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Apr 26, 2023

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Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 164 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Dreidimensionale Netzhautorganoide (3D-Retinas) sind eine vielversprechende Transplantatquelle für die Transplantationstherapie. Wir haben zuvor eine selbstorganisierende Kultur für die 3D-Retina-Erzeugung aus menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) entwickelt. Hier stellen wir eine Qualitätskontrollmethode und präklinische Studien zur Gewebeblatttransplantation vor. Selbstorganisierende hPSCs differenzierten sowohl in Netzhaut- als auch in Off-Target-Gewebe. Genexpressionsanalysen identifizierten die wichtigsten Off-Target-Gewebe als augenbezogene, kortexähnliche und rückenmarksähnliche Gewebe. Zur Qualitätskontrolle haben wir einen qPCR-basierten Test entwickelt, bei dem jedes von hPSC abgeleitete Neuroepithel in zwei Gewebeschichten zerlegt wurde: die innere zentrale Schicht für die Transplantation und die äußere periphere Schicht für die qPCR, um die Auswahl des Netzhautgewebes sicherzustellen. Während der qPCR wurden Gewebeblätter mithilfe einer neu entwickelten Konservierungsmethode 3–4 Tage lang gelagert. In einer Tumorigenitätsstudie an Ratten wurden keine transplantationsbedingten unerwünschten Ereignisse beobachtet. Bei Modellratten zur Netzhautdegeneration differenzierten sich Netzhauttransplantate zu reifen Photorezeptoren und zeigten in elektrophysiologischen Tests Lichtreaktionen. Diese Ergebnisse veranschaulichen unsere Beweggründe für eine selbstorganisierende Netzhauttransplantationstherapie.

Pluripotente Stammzellen (PSCs) haben die Fähigkeit, dreidimensionales (3D) Nervengewebe selbst zu organisieren1. Selbstorganisierende Aggregate mit 3D-Gewebe werden Organoide genannt und stellen vielversprechende Transplantatquellen für die Zell-/Gewebetransplantationstherapie dar. Im Hinblick auf die Therapie einer menschlichen Netzhauttransplantation wurden mehrere Methoden zur Differenzierung der Netzhaut entwickelt2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Unter anderem ist eine selbstorganisierende Stammzellkulturtechnologie, SFEBq (serumfreie schwimmende Kultur embryoider körperähnlicher Aggregate mit schneller Aggregation), für die 3D-Retina-Erzeugung nützlich5,6,7,8,15,17. Wir haben zuvor die SFEBq-Methode durch eine zeitgesteuerte Behandlung mit knochenmorphogenetischem Protein (BMP) modifiziert, um 3D-Retinas aus Feeder-freien menschlichen embryonalen Stammzellen (ESCs) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zu erzeugen7,8. Die 3D-Netzhäute in diesem Kultursystem enthalten neurale Netzhautvorläufer (retinale Vorläuferzellen), die sich ausdehnen, um Photorezeptoren und andere Netzhautneuronen entstehen zu lassen und in stadienabhängiger Weise ein mehrschichtiges, geschichtetes Netzhautgewebe zu bilden, das die Entwicklung in vivo nachbildet.

Retinitis pigmentosa ist eine Gruppe von Erbkrankheiten, die durch einen fortschreitenden Verlust von Stäbchen-Photorezeptoren gefolgt von Zapfen-Photorezeptoren gekennzeichnet sind und die Hauptursache für Blindheit in entwickelten Ländern sind. Die Transplantation von Photorezeptoren und/oder retinalen Vorläuferzellen ist eine vielversprechende Therapieoption23,24,25,26. Tatsächlich hatte die Transplantation von Netzhautgewebe und -zellen aus primären embryonalen Geweben das Potenzial, die Sehfunktion zu verbessern23,27,28,29, obwohl die Beiträge der Gewebe-/Zelltransplantation und des Spender-Wirt-Materialtransfers noch untersucht werden müssen30. Um ausreichende Mengen an Netzhautgewebe und -zellen für die Zelltherapie bereitzustellen, stellen aus PSCs erzeugte 3D-Netzhäute eine vielversprechende Transplantatquelle dar. Aus PSC-abgeleiteten Netzhäuten gereinigte Photorezeptorvorläufer können überleben, Kontakt mit der Wirtsnetzhaut herstellen und die Sehfunktion verbessern10,17,18,26,31,32. Aus 3D-Netzhäuten präparierte Netzhautgewebeschichten von Mäusen und Menschen (im Folgenden Netzhautschichten) wurden in Modellmäuse und -ratten im Endstadium der Netzhautdegeneration eingepflanzt und zeigten eine funktionelle Reifung, die zur Wiederherstellung der Lichtreaktionen führte33,34,35,36,37. Darüber hinaus hatten von hPSC abgeleitete 3D-Retinas eine geringe Immunogenität und immunsuppressive Eigenschaften38. Die Transplantation menschlicher PSC-Netzhautschichten in Primatenmodellen mit Netzhautdegeneration zeigte eine langfristige Transplantation über 2 Jahre36,39. Diese präklinischen Transplantationsstudien weisen darauf hin, dass allogene PSC-abgeleitete Netzhautschichten das Potenzial haben, die Sehfunktion zu verbessern.

Im Hinblick auf klinische Anwendungen auf PSC-abgeleiteten Netzhautschichten ist die Etablierung einer Qualitätskontrollstrategie (QC) für 3D-Netzhäute (Zwischenprodukte) und präparierte Netzhautschichten (Endprodukte) nach wie vor eine große Herausforderung. Die selbstorganisierende Kultur wurde verbessert, um die Variation der Organoide sowohl auf der Ebene innerhalb als auch zwischen den Chargen zu verringern. Eiraku und Kollegen entwickelten die SFEBq-Methode zur Regulierung der Größe und Qualität von PSC-abgeleiteten Aggregaten5,40. Wir haben ein modifiziertes Kultursystem entwickelt, um die Vielfalt der Organoidqualität zu reduzieren, wie z. B. die Organoidmorphologien und Proportionen der neuralen Netzhaut (Retina) und des retinalen Pigmentepithels (RPE)7,8, obwohl einzelne Organoide immer noch unterschiedliche 3D-Morphologien und mehrere Abweichungen aufweisen. Zielgewebe. Einige Gewebe außerhalb des Ziels wurden als RPE-Gewebe und kortexähnliches Gewebe identifiziert7,12. In unseren früheren Transplantationsstudien wurden PSC-Linien verwendet, die fluoreszierende Protein-Knock-in-Reporterlinien für Rx (auch Rax genannt) und Crx enthalten, um für die Transplantation geeignete Netzhautzellen zu markieren6,35,39. Allerdings sind xenogene fluoreszierende Protein-Knock-in-Reporterlinien nicht ideal für klinische Anwendungen. Hier etablieren wir eine neue QC-Strategie zur Auswahl von Netzhautgewebe in den Organoiden. Anschließend führten wir präklinische Sicherheits- und Wirksamkeitsstudien durch, um die Gründe für die allogene Netzhauttransplantationstherapie zu demonstrieren.

Im Hinblick auf die Netzhautgewebetransplantationstherapie haben wir eine robuste Methode zur Differenzierung der Netzhaut entwickelt, die aus fünf Prozessen besteht, die auf früheren Studien basieren:5,6,7,8,33,39 (1) Erhaltungskultur mit Feeder-freier hPSC-Kultur und Vorkonditionierungsmethoden, ( 2) Netzhautdifferenzierung mit SFEBq- und BMP-Methoden, (3) Induktionsumkehrkultur, (4) Reifungskultur und (5) Dissektion (Abb. 1a).

ein Schema der selbstorganisierenden Kultur. b Hellfeldansicht eines von iPSC-S17 abgeleiteten Zellaggregats, das Netzhautgewebe enthält, an den Tagen 14, 42, 91 und 180 (oben). Maßstabsleiste in der Hellfeldansicht: 100 µm. Immunfärbung von iPSC-S17-abgeleitetem Netzhautgewebe an den Tagen 14, 42, 91 und 180 (Mitte und unten). Crx (grün) und Chx10 (rot) in den Mittelfeldern. Pax6 (grün) und Recoverin (rot) in den unteren Feldern. Blau: Kernfärbung mit DAPI. Maßstabsbalken bei der Immunfärbung: 20 µm. c Immunfärbung von iPSC-S17-abgeleitetem Netzhautgewebe am Tag 180. RXRG (grün) und NRL (rot) im oberen linken Feld. Lhx2 (rot) im oberen rechten Bereich. CtBP2 (grün) und Recoverin (rot) im unteren linken Feld. Kegelarrestin (grün) im unteren rechten Feld. Blau: Kernfärbung mit DAPI. Maßstabsleiste: 20 µm. d Genexpressionsanalyse in iPSC-S17-abgeleiteten Zellaggregaten, die Netzhautgewebe enthalten, an den Tagen 0, 6, 14, 45, 60 und 80. In jedem Replikat wurde RNA aus 48 Aggregaten extrahiert. Die mRNA-Spiegel wurden durch qPCR-Analyse bestimmt. Die relative mRNA-Expression wurde mit der Delta-Delta-Ct-Methode mit GAPDH als endogener Kontrolle bestimmt. Die Daten werden als Mittelwert ± SE (n = 4 pro Zeitpunkt) dargestellt. e Hellfeldansicht der iPSC-S17-abgeleiteten Netzhautschicht. Maßstabsbalken: 100 µm. f Immunfärbung der iPSC-S17-abgeleiteten Netzhautschicht am Tag 87. Crx (grün) und Chx10 (rot) im linken Feld. Rx (grün) und Recoverin (rot) im rechten Feld. Blau: Kernfärbung mit DAPI. Maßstabsbalken: 100 µm.

In Prozess 1 wurden menschliche iPSC-Zelllinien auf der LM511-E8-Matrix in StemFit-Medium gehalten41,42. Vier iPSC-Zelllinien, iPSC-S17, iPSC-LPF11, iPSC-1231A3 und iPSC-QHJI01s04 (iPSC-Q), wurden in dieser Feeder-freien Erhaltungskultur stabil vermehrt und ihre Verdopplungszeit betrug etwa 12–18 Stunden. iPSCs wurden vor der Differenzierung 18–30 Stunden lang mit SB431542 (SB; Inhibitor des TGF-beta/Nodal/Activin-Signals) plus Smoothened-Agonist (SAG; Shh-Signalagonist) vorkonditioniert (im Folgenden SB + SAG)8. In Prozess 2 wurde eine 3D-Retina-Differenzierungskultur mit der SFEBq-BMP-Methode durchgeführt. iPSCs wurden in einzelne Zellen dissoziiert, in 96-Well-Platten mit V-Boden ausplattiert und in Differenzierungsmedium (wachstumsfaktorfreies CDM [gfCDM] + Knockout Serum Replacement [KSR]) in Gegenwart von Y-27632 und SAG8 kultiviert. Die resultierenden iPSC-Aggregate wurden am dritten Tag mit BMP4 behandelt und in gfCDM+KSR-Medium7 kultiviert. Am 14. Tag wurden die iPSC-Aggregate fixiert und auf die retinalen Vorläufermarker Pax6 und Chx10 (auch Vsx2 genannt) immungefärbt. Es wurde festgestellt, dass die iPSC-Aggregate ein Neuroepithel auf ihrer Oberfläche enthielten, und die Mehrheit der Zellen im Neuroepithel war positiv für Chx10 und Pax6, was darauf hinweist, dass iPSCs selbst unreifes Netzhautgewebe bildeten (Abb. 1b). In Prozess 3 wurde das unreife Netzhautgewebe mithilfe einer Induktionsumkehrkulturmethode kultiviert, um die Anteile der neuralen Netzhaut (Retina) und RPE7 genau zu regulieren. Das unreife Netzhautgewebe wurde 3 Tage lang mit CHIR99021 (CHIR; Wnt-Agonist) und SU5402 (SU; FGFR-Inhibitor) kultiviert, um die Zellen auf das RPE-Schicksal auszurichten, und dann 23 Tage lang in Retina-Reifungsmedium mit Serum und Taurin weiter kultiviert, um es zu erhalten ein Induktionsumkehr-Zwischenprodukt. In Prozess 4 wurde das Induktionsumkehr-Zwischenprodukt 20–60 Tage lang in Retina-Reifungsmedium mit Serum, Taurin und T3 weiter kultiviert, um die 3D-Retina zu erhalten. An den Tagen 60–100 wurde die 3D-Retina fixiert und auf Chx10, Pax6, Crx (Photorezeptor-Vorläufermarker) und Recoverin (Photorezeptormarker) immungefärbt. Es wurde festgestellt, dass die 3D-Netzhaut ein mehrschichtiges Netzhautgewebe enthält, bestehend aus einer Photorezeptor-Vorläuferschicht mit Crx+- und Recoverin+-Zellen auf der Außenfläche, einer Netzhaut-Vorläuferschicht mit Chx10+/Pax6+-Zellen in der Mitte und einer neuronalen Schicht mit Chx10−/Pax6++ Zellen und Crx+- und Recoverin+-Zellen auf der Innenseite (Abb. 1b und ergänzende Abb. 1a, b, c).

Wir kultivierten außerdem 3D-Netzhäute in einem Langzeitreifungsmedium, das all-trans-Retinsäure enthielt, um die Expression von Netzhautreifungsmarkern zu untersuchen. Es wurde bestätigt, dass die 3D-Netzhäute am Tag 180 ein mehrschichtiges Netzhautgewebe mit Photorezeptor- und Netzhaut-Vorläuferschichten enthielten (Abb. 1b, c). NRL+-, RXRG+- und Cone-Arrestin+-Zellen wurden in der äußeren Photorezeptorschicht der 3D-Retina gefunden, was auf eine Differenzierung in Stäbchenvorläufer und Zapfenvorläufer hinweist (Abb. 1c). Die Lhx2+-Neuronenschicht wurde auf der Innenseite der 3D-Retina gefunden (Abb. 1c). Einige Recoverin+-Zellen exprimierten CtBP2 (auch Ribeye genannt), was darauf hindeutet, dass von iPSC abgeleitete Photorezeptoren die Fähigkeit hatten, synaptische Photorezeptorproteine ​​zu exprimieren (Abb. 1c und ergänzende Abb. 1d).

Zur Analyse der Genexpression führten wir an den Tagen 0, 6, 14, 45, 60 und 80 qPCR-Analysen von iPSC-Aggregaten durch (Abb. 1d und ergänzende Abb. 1e). Die mRNA-Spiegel der retinalen Vorläufermarker (Rx, Chx10), der Photorezeptormarker (Crx, Recoverin) und eines Zapfen-Photorezeptorvorläufermarkers (RXRG) waren am Tag 6–14, am Tag 45 bzw. am Tag 60 erhöht. Der mRNA-Spiegel des PSC-Markers Oct3/4 war am 6. Tag verringert. Diese Daten stimmen mit früheren Studien zur 3D-Netzhautdifferenzierungskultur überein5,6,7,8.

In Prozess 5 wurden 3D-Netzhäute an den Tagen 60–100 in Netzhautschichten (Endprodukte) zerlegt (Abb. 1e)33,39. Wir überprüften die Morphologie der Netzhautschichten mittels immunhistochemischer (IHC) Analyse und beobachteten ein mehrschichtiges kontinuierliches Netzhautgewebe mit einer Photorezeptor-Vorläuferschicht, die Crx+- und Recoverin+-Zellen enthielt, auf der Außenfläche und einer Netzhaut-Vorläuferzellschicht mit Chx10+- und Rx+-Zellen auf der Innenseite (Abb. 1f). Mit diesen fünf Verfahren wurden reproduzierbar menschliche allogene iPSC-abgeleitete Netzhautschichten erzeugt.

Die selbstorganisierende Kultur ahmte die Embryonalentwicklung nach, um sowohl Netzhautgewebe als auch Off-Target-Gewebe zu induzieren. Wir versuchten, die wichtigsten Off-Target-Gewebe in dieser Kultur anhand der Morphologie der Aggregate zu identifizieren. iPSC-LPF11-Zellen, die durch selbstorganisierende Kultur in Richtung Netzhautschicksal differenziert wurden, wurden einer Hellfeldmikroskopieanalyse unterzogen. Wir fanden heraus, dass sich iPSC-LPF11-Zellen selbst zu Netzhautgewebe und drei Off-Target-Geweben organisierten, die eine andere Morphologie als das Netzhautgewebe aufwiesen (Off-Target-Gewebe 1, -2 und -3) (Abb. 2a). Die typische Morphologie des Netzhautgewebes war die mehrschichtige kontinuierliche Neuroepithelstruktur mit einer hellen Außenschicht und einer braunen Innenschicht (Abb. 1b und 2a). Die typischen Morphologien der Off-Target-Gewebe waren pigmentiertes und/oder nicht pigmentiertes dünnfaltiges Epithel (Off-Target-Gewebe-1), klebrige Zellaggregate mit einer rauen Außenoberfläche (Off-Target-Gewebe-2) und dunkel- farbige Aggregate mit verstopftem Innenteil (Off-Target-Gewebe-3) (Abb. 2a). Wir unterschieden drei unabhängige Kulturchargen aus zwei Zelllinien, iPSC-LPF11 und iPSC-S17, und untersuchten die Anteile von Aggregaten, die Netzhautgewebe und Off-Target-Gewebe enthalten (Abb. 2b, n = 59–95 Aggregate pro Charge). Bei allen Chargen enthielten die meisten Aggregate Netzhautgewebe und der Anteil der Aggregate, die Nicht-Zielgewebe 1 enthielten, war tendenziell höher als der Anteil der Aggregate, die Nicht-Zielgewebe 2 oder Nicht-Zielgewebe 3 enthielten.

a Hellfeldansicht von Netzhautgewebe und Off-Target-Geweben in iPSC-LPF11-abgeleiteten Zellaggregaten. Maßstabsbalken: 100 µm. b Anteile der Zellaggregate, die Netzhautgewebe und Off-Target-Gewebe enthalten. Es wurden drei unabhängige Chargen aus iPSC-LPF11-Zellen und drei unabhängige Chargen aus iPSC-S17-Zellen analysiert (n = 59–95 Aggregate pro Charge). Die Daten werden als Mittelwert ± SE dargestellt. c Wärmekarte für Genexpressionen in Netzhautgewebe und Off-Target-Geweben, die aus iPSC-LPF11-Zellen stammen. Als Kontrolle werden auch Genexpressionen in undifferenzierten iPSC-LPF11-Zellen gezeigt. Die Genexpression wurde durch qPCR-Analysen gemessen. Für jedes Gewebe wurden Zeilen-Z-Scores berechnet und als Wärmekarte dargestellt. d Repräsentative Hellfeldbilder und IHC-Bilder für Off-Target-Gewebe-1 und -2, abgeleitet von iPSC-LPF11-Zellen. Die Hellfeldbilder und IHC-Bilder wurden an den gleichen Positionen aufgenommen. Dargestellt ist die Immunfärbung für Aqp1 (oben rechts; rot) und Emx2 (unten rechts; rot). Blau: Kernfärbung mit DAPI. Maßstabsbalken: 100 µm. e Wärmekarte für Genexpressionen in Netzhautgewebe und Off-Target-Gewebe-3, abgeleitet von iPSC-1231A3-Zellen. Die mRNA-Spiegel wurden durch Microarray-Analyse bestimmt. LogFC-Werte wurden für jedes Gen berechnet und als Heatmap dargestellt. FC, Faltwechsel. Beachten Sie, dass Off-Target-Gewebe-3 im Vergleich zu Netzhautgewebe Hox-Gene exprimierte.

Um die Zelllinien zu identifizieren, wurden von iPSC abgeleitetes Off-Target-Gewebe-1, Off-Target-Gewebe-2 und Off-Target-Gewebe-3 manuell präpariert, möglicherweise mit kleinen Mengen umgebender Gewebe, und die mRNA-Spiegel der Schlüsselgene zugeordnet mit Schicksalswahl, Differenzierung und/oder Musterung wurden durch qPCR-Analyse bestimmt. Basierend auf den Ct-Werten für jedes Gen haben wir Z-Scores für jedes Gewebe berechnet und als Wärmekarte dargestellt, um die Genexpressionsmuster in den Geweben zu analysieren (Abb. 2c). Wir fanden heraus, dass Off-Target-Gewebe-1 Aqp1 und Mitf exprimierte, was darauf hinweist, dass es sich um Augengewebe mit RPE und Ziliarkörper handelte43,44. Off-Target-Gewebe-2 exprimierte Emx2, was darauf hinweist, dass es sich um embryonales kortexähnliches Gewebe handelte45. Off-Target-Gewebe-3 zeigte eine hohe Expression des Homöobox-Gens HoxB246,47. Der undifferenzierte hPSC-Marker Lin28a wurde in den drei Off-Target-Geweben oder im Netzhautgewebe nicht nachgewiesen48.

Wir führten IHC-Analysen durch und bestätigten, dass Off-Target-Gewebe-1 positiv für RPE und den Ziliarkörpermarker Aqp1 war, während Off-Target-Gewebe-2 positiv für den embryonalen kortikalen (dorsal-telenzephalen) Marker Emx2 war (Abb. 2d und ergänzende Abb. 2a). ). Wir untersuchten die Genexpression in Off-Target-Gewebe-3 mittels Microarray-Analyse und stellten fest, dass es mehrere Hox-Gene einschließlich HoxB2 exprimierte, was darauf hindeutet, dass es sich um posterior-neurales rückenmarksähnliches Gewebe handelte (Abb. 2e). Wir haben außerdem bestätigt, dass sich die Genexpressionsmuster in den Off-Target-Geweben von denen in den Netzhautgeweben unterschieden (ergänzende Abbildung 2b).

Insgesamt differenzierten hPSCs unter Verwendung der selbstorganisierenden Kulturmethode stark, um ein mehrschichtiges Netzhautgewebe zu bilden, und die wichtigsten Off-Target-Gewebe waren Aqp1+-Augengewebe (Off-Target-Gewebe-1) und Emx2+-Cortex-ähnliches Gewebe (Off-Target-Gewebe). -2) und HoxB2+ rückenmarksähnliches Gewebe (Off-Target-Gewebe-3).

Das selbstorganisierte Netzhautgewebe hatte eine einzigartige mehrschichtige kontinuierliche Neuroepithelstruktur (Abb. 1 und 2). Daher können wir das Netzhautgewebe identifizieren, indem wir die Aggregate während der Präparation sorgfältig unter einem Hellfeldmikroskop beobachten (Prozess 5). Allerdings differenzierten sich PSCs in dieser Kultur nicht nur in Netzhautgewebe, sondern auch in Gewebe außerhalb des Ziels (Abb. 2), was das potenzielle Risiko birgt, dass Gewebe außerhalb des Ziels präpariert werden, um das Endprodukt zu erzeugen. Im Hinblick auf klinische Anwendungen wollten wir eine ausfallsichere QC-Methode entwickeln, um die Auswahl transplantierbarer Netzhautschichten sicherzustellen und zu verhindern, dass versehentlich Gewebe außerhalb des Ziels einbezogen wird. Obwohl der qPCR-basierte QC-Test für alle Netzhautschichten eine empfindliche Methode zum Nachweis von Off-Target-Geweben darstellt, führt die Durchführung dieses Tests zur Zerstörung aller transplantierbaren Netzhautschichten. Um diese Zerstörung zu vermeiden, haben wir beschlossen, das kontinuierliche Neuroepithel in zwei Gewebeschichten zu zerlegen: die innere zentrale Schicht für die Transplantation (genannt „Kappe“) und die äußere periphere Schicht für den QC-Test (genannt „Ring“) (Abb. 3a). ). Um die Genexpression jedes inneren zentralen Blatts (Kappe) abzuschätzen, führen wir eine qPCR-Analyse jedes entsprechenden äußeren peripheren Blatts (Rings) durch (Abb. 3a; Ring-PCR-Test im Folgenden).

ein Schema für die Dissektion von Kappe und Ring und den Ring-PCR-Test in Prozess 5 (Dissektion). b Hellfeld- (links) und IHC-Bilder (Mitte, rechts) einer repräsentativen Kappe und eines Rings. Die Kappe und der Ring wurden von iPSC-LPF11-Zellen abgeleitet. Dargestellt ist die Immunfärbung für Crx (Mitte, grün), Chx10 (Mitte, rot), Pax6 (rechts, grün) und Recoverin (rechts, rot). DAPI wird blau angezeigt. Maßstabsbalken: 100 µm. c Wärmekarte für Genexpressionen in Kappen und Ringen, die von iPSC-LPF11-Zellen stammen. Als Kontrolle werden auch Genexpressionen in undifferenzierten iPSC-LPF11-Zellen gezeigt. Die Genexpression wurde durch qPCR-Analysen gemessen. Für jede Kappe und jeden Ring wurden Zeilen-Z-Scores berechnet und als Wärmekarte dargestellt. d Repräsentative Genexpressionen in Kappe und Ring, seziert aus demselben Aggregat, dargestellt als Diagramm mit einer Regressionslinie (links). Das Bestimmtheitsmaß (R2) für die Genexpression zwischen jeder Kappe und jedem Ring ist dargestellt (rechts). Nr. 1–Nr. 6 entsprechen Gewebe Nr. 1–Nr. 6 in (c). e Violindiagramme von Einzelzell-PCR-Daten, die aus einer Netzhautschicht, Off-Target-Gewebe 1, Off-Target-Gewebe 2 und undifferenzierten iPSCs gewonnen wurden. Gezeigt werden Genexpressionen für Photorezeptorzellen (Crx, Recoverin), retinale Vorläuferzellen (Chx10, Rx, Pax6), andere retinale Neuronen (Pax6, AP2A, STMN2) und Off-Target-Gewebe (Aqp1, Emx2, HoxB2, Lin28a). .

Das kontinuierliche Neuroepithel, das sich in der iPSC-abgeleiteten 3D-Retina selbst gebildet hatte, wurde in die Kappe und den Ring zerlegt (Abb. 3a, b). Sowohl die Kappe als auch der Ring enthielten ein mehrschichtiges, kontinuierliches Netzhautgewebe, bestehend aus einer Photorezeptor-Vorläuferschicht mit Crx+- und Recoverin+-Zellen auf der Außenfläche und einer Netzhaut-Vorläuferzellschicht mit Chx10+- und Pax6+-Zellen auf der Innenseite.

Wir verglichen die Genexpressionsmuster in den Kappen und Ringen. Verschiedene Neuroepithelien wurden in Kappen- und Ringgewebe zerlegt und die Genexpression wurde durch qPCR bestimmt (Abb. 3c). Wir fanden heraus, dass die Genexpressionsmuster in jeder Kappe und jedem Ring desselben Neuroepithels ähnlich waren. Um die Ähnlichkeit statistisch zu analysieren, haben wir Regressionslinien für die Genexpression in jeder Kappe und jedem Ring gezeichnet und den Bestimmtheitskoeffizienten (R2) berechnet. Wir fanden heraus, dass die R2-Werte für alle Kappen- und Ringsätze fast 1,0 lagen (Abb. 3d und ergänzende Abb. 3a, b). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Genexpressionsniveaus von Netzhautgenen und Off-Target-Gewebemarkergenen zwischen Kappe und Ring, die aus demselben Aggregat präpariert wurden, nahezu gleich sind.

Anschließend führen wir eine qPCR für jeden Ring durch (Abb. 3a, Ring-PCR-Test). Wenn ein Ring Netzhautgene exprimiert und nicht so sehr Gewebemarkergene außerhalb des Ziels wie Gewebe Nr. 1–6 in Abb. 3c, kann die entsprechende Kappe als Netzhautschicht (Endprodukt) für die Transplantation ausgewählt werden. Die aus vier iPSC-Linien abgeleiteten und den Ring-PCR-Test bestandenen Netzhautschichten zeigten tatsächlich ähnliche Muster der Netzhautgenexpression (ergänzende Abbildung 3c). Wir führten außerdem eine Einzelzell-PCR-Analyse (scPCR) durch und stellten fest, dass die Mehrheit der Zellen in den Netzhautschichten Chx10, Crx, Recoverin, Rx, Pax6, AP2A oder STMN2 exprimierten (Abb. 3e).

Diese Ergebnisse zeigten, dass der Ring-PCR-Test die Genexpression in der Kappe abschätzen kann, um aus Netzhautzellen bestehende Netzhautschichten auszuwählen.

Zwischen dem Dissektionsprozess und der Transplantation der Netzhautschicht ist es notwendig, Qualitätskontrolltests einschließlich des Ring-PCR-Tests durchzuführen, um transplantierbare Netzhautschichten auszuwählen. Allerdings dauert die Durchführung des Ring-PCR-Tests mindestens 1–2 Tage. Obwohl Netzhautgewebe eingefroren und aufgetaut werden kann, wie bereits berichtet6,20, zeigte die subretinale Transplantation von gefrorenem Netzhautgewebe bei Nacktratten eine beeinträchtigte Transplantation. Unser Ziel war es daher, eine Methode zur gefrierfreien Konservierung von Netzhautgewebe zu entwickeln.

Wir untersuchten zunächst das optimale Medium und die optimale Temperatur für die frostfreie Konservierung von iPSC-abgeleiteten 3D-Netzhäuten und präparierten Netzhautschichten. Um das optimale Medium zu bestimmen, haben wir das Reifungsmedium der Netzhaut, die Lösung der University of Wisconsin (UW), die ausgewogene Salzlösung (BSS) und Optisol-GS (im Folgenden Optisol) als mögliche Konservierungslösungen bewertet49,50,51, bei 4, 17, und 37 °C. Von iPSC abgeleitete 3D-Retinas wurden erzeugt, 3 Tage lang unter verschiedenen Bedingungen konserviert und 7 Tage lang in Retina-Reifungsmedium bei 37 ° C als Erholungskultur kultiviert (Abb. 4a, b). Die konservierten Netzhäute und Kontrollnetzhäute wurden fixiert und immungefärbt, um die Morphologie des Netzhautgewebes zu überprüfen. Wir fanden heraus, dass die Konservierung bei 17 °C mit BSS oder Optisol optimale Bedingungen für die Aufrechterhaltung der mehrschichtigen kontinuierlichen Netzhautepithelstruktur darstellt (Abb. 4a). Eine Aufbewahrung bei 4 °C war keine bevorzugte Bedingung, da sie möglicherweise zu einer Schädigung der Netzhaut führte. UW-Lösung, ein goldener Standard für die Konservierung peripherer Gewebe einschließlich der Bauchspeicheldrüse, wurde ebenfalls nicht bevorzugt. Einer der Unterschiede zwischen UW-Lösung und Optisol war die Konzentration von Kaliumchlorid (KCl): 120 mM in UW-Lösung und 5,33 mM in Optisol. Tatsächlich beeinträchtigte mit 120 mM KCl ergänztes Optisol die Morphologie des Netzhautgewebes (ergänzende Abbildung 4a). Konsistent betrug die KCl-Konzentration in BSS und Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Basalmedium für Säugetierzellkulturen) 5,3 mM und eine Aufbewahrung bei 17 °C in BSS und DMEM erwies sich als vorzuziehen (Abb. 4a und ergänzende Abb. 4b). Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die KCl-Konzentration ein Schlüsselfaktor für die Konservierungslösung sein könnte. Aufgrund dieser Ergebnisse haben wir uns für Optisol als nicht gefrierfeste Konservierungslösung entschieden, da Optisol klinisch häufig für Hornhauttransplantationen beim Menschen eingesetzt wird51.

a Screening auf die frostfreien Konservierungsbedingungen. +++: Mehrschichtiges durchgehendes Netzhautepithel blieb erhalten. ++: Das mehrschichtige kontinuierliche Netzhautepithel blieb erhalten, es traten jedoch neurale Rosetten auf. +: Es wurde ein mehrschichtiges kontinuierliches Netzhautepithel beobachtet, jedoch nur in sehr begrenztem Umfang. – wurde nach der Konservierung kein mehrschichtiges kontinuierliches Netzhautepithel beobachtet. b Schema der Konservierungsexperimente. c Anteile von Crx+-Photorezeptorvorläufern in mehrschichtigen Netzhautgeweben. Die Anteile wurden berechnet, indem die Anzahl der Crx+-Zellen durch die Anzahl der Zellkerne (DAPI) dividiert wurde. Die Daten werden als Mittelwert ± SE für n = 5 (4 °C), 4 (12 °C), 4 (15 °C), 5 (17 °C), 5 (20 °C), 5 (22 °C) dargestellt ), 4 (37 °C) und 3 (Kontrollkultur). d Zelllebensfähigkeit in nicht konservierten Netzhäuten (Kontrolle) und Netzhäuten, die 4 Tage lang konserviert wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SE (n = 5 pro Gruppe) angezeigt. e Genexpressionen von Chx10 und Crx in nicht konservierten Netzhäuten (Kontrolle) und Netzhäuten, die 4 Tage lang konserviert wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SE (n = 3 pro Gruppe) dargestellt. f IHC-Analyse von Netzhäuten, die nicht konserviert (d70 + 0), 2 Tage (d70 + 2) und 4 Tage (d70 + 4) in Optisol konserviert und 4 Tage in Optisol konserviert wurden, gefolgt von einer Erholungskultur für 3 Tage ( d70 + 4 + 3) und 7 Tage (d70 + 4 + 7). Ki67-Flecken (rot) in den oberen Platten. EdU-Färbung (grün) in den unteren Bereichen. DAPI wird blau angezeigt. Maßstabsbalken: 50 µm. g Anzahl der EdU-positiven Zellen pro 100 µm breitem mehrschichtigem Netzhautgewebe in jeder Gruppe. Die Daten werden als Mittelwert ± SE dargestellt (n = 6 pro Gruppe). ***p < 0,001 für einfaktorielle ANOVA gefolgt von einem Tukey-Test. h Schema für Präparation, Ring-PCR-Test und Versand von Netzhautschichten. ns, nicht signifikant.

Um die optimale Temperatur für die Konservierung zu bestimmen, wurden 3D-Retinas 3 Tage lang in Optisol bei 4, 12, 15, 17, 20, 22 und 37 °C konserviert und dann 7 Tage lang in Retina-Reifungsmedium bei 37 °C kultiviert die Erholungskultur (Abb. 4b). Wir führten eine IHC-Analyse durch und stellten fest, dass die Anteile an Crx+-Zellen bei 12, 15, 17, 20 und 22 °C höher waren als bei 4 und 37 °C und dass die Anteile an Crx+-Zellen bei 17, 20 und 22 °C lagen waren viel höher (Abb. 4c). Daher lag der bevorzugte Bereich der Aufbewahrungstemperatur bei 17 ± 5 °C und die optimale Temperatur bei 17–22 °C.

Wir untersuchten die Lebensfähigkeit der Zellen und die Genexpression in Netzhäuten, die 4 Tage lang bei 17 °C in Optisol konserviert wurden. Die Zelllebensfähigkeit in den konservierten Netzhäuten überstieg 95 % und war ähnlich der in Kontrollnetzhäuten in Kultur (Abb. 4d). Die mRNA-Spiegel von Chx10 und Crx in den konservierten Netzhäuten waren mit denen in Kontrollnetzhäuten in Kultur vergleichbar (Abb. 4e). Darüber hinaus waren die mRNA-Spiegel von Chx10 und Crx in Netzhäuten, die 7 Tage lang bei 17 °C in Optisol konserviert wurden, mit denen in Kontrollnetzhäuten in Kultur vergleichbar. Diese Ergebnisse zeigten, dass eine gefrierfreie Aufbewahrung in Optisol bei 17 °C die optimale Bedingung für Netzhautgewebe darstellte.

Wir analysierten den Zustand von Netzhautgewebe, das bei 17 °C konserviert wurde. Kontrollnetzhäute vor der Konservierung (d70 + 0), Netzhäute, die in Optisol bei 17 °C für 2 Tage (d70 + 2) und 4 Tage (d70 + 4) konserviert wurden, und Netzhäute, die durch Kultur bei 37 °C für 3 Tage gewonnen wurden (d70 +). 4 + 3) und 7 Tage (d70 + 4 + 7) wurden 4 Stunden lang mit dem Thymidinanalogon 5-Ethinyl-2'-desoxyuridin (EdU) behandelt, um proliferierende Zellen in der S-Phase des Zellzyklus zu markieren, und histologisch untersucht Analyse. Die Expression von Ki67 wurde in beiden Kontrollnetzhäuten vor der Konservierung und in den bei 17 ° C konservierten Netzhäuten nachgewiesen (Abb. 4f, d70 + 2 und d70 + 4). Im Gegensatz dazu wurden in bei 17 °C konservierten Netzhäuten keine EdU+-Zellen nachgewiesen (Abb. 4f, g, d70 + 2 und d70 + 4), was darauf hinweist, dass konservierte Netzhautvorläufer vor dem Eintritt in die S-Phase angehalten wurden. Wichtig ist, dass die EdU-Aufnahme während der Erholungskultur hochreguliert wurde, was darauf hinweist, dass die Proliferationsfähigkeit reversibel war (Abb. 4f, g und ergänzende Abb. 4c, d). Die Anzahl der gespaltenen Caspase-3+-Zellen (apoptotische Zellen) war in den konservierten Netzhäuten leicht hoch, während die Zahlen in den wiederhergestellten Netzhäuten (d70 + 4 + 3 und d70 + 4 + 7) denen in Kontrollnetzhäuten ähnlich waren (Ergänzung). Abb. 4c).

Durch die Kombination der nicht gefrierenden Konservierungsmethode bei kontrollierter Raumtemperatur (im Folgenden RT-Konservierungsmethode) mit dem Ring-PCR-Test haben wir eine QC-Methode für die Dissektion von 3D-Netzhäuten (Prozess 5) wie folgt entwickelt: (1) Dissektion der Kappe und Ring aus jeder 3D-Netzhaut, (2) Konservierung der Kappen bei 17 °C durch die RT-Konservierungsmethode, (3) der Ring-PCR-Test zur Auswahl bestandener und nicht bestandener Ringe, (4) Ausschluss entsprechender Kappen fehlgeschlagene Ringe zur Auswahl der Netzhautschichten (Endprodukte) und (5) Versand der Netzhautschichten zur Transplantation (Abb. 4h).

Eine In-vivo-Tumorigenitätsstudie der Netzhautschicht wurde durch subretinale Transplantation an immundefizienten Nacktratten durchgeführt. Netzhautschichten wurden aus iPSC-Q-Zellen erzeugt und mit der RT-Konservierungsmethode 3–4 Tage lang gelagert. Die immundefizienten Nacktratten wurden in intakte (n = 8), Scheinoperationen (n = 12) und transplantierte Gruppen (n = 21) eingeteilt, und die Ratten in der letzteren Gruppe wurden einer subretinalen Transplantation einer Netzhautschicht im subretinalen Raum unterzogen ( Ergänzende Abb. 5a–f). Jede transplantierte Netzhautschicht (Transplantat) befand sich ordnungsgemäß im subretinalen Raum, was durch Fundusbildgebung und optische Kohärenztomographie (OCT)-Analyse bestätigt wurde (ergänzende Abbildung 5b).

Die transplantierten Ratten zeigten im Beobachtungszeitraum von bis zu 78 Wochen nach der Transplantation im Vergleich zu intakten oder scheinoperierten Ratten keine Auffälligkeiten in ihrem Körpergewicht, ihren Überlebensraten und klinischen Symptomen (Abb. 5a, b).

Zeitliche Verläufe des Körpergewichts (a) und der Kaplan-Meier-Überlebenskurven (b) bei nackten Ratten in der Tumorigenitätsstudie. Intakt: Nackte Kontrollratte ohne Operation (n = 4). Schein: nackte Kontrollratte mit subretinaler Injektion des Kontrollvehikels (n = 4). Transplantiert: Nacktratte mit subretinaler Transplantation einer einzelnen iPSC-Q-abgeleiteten Netzhautschicht (n = 4). Die Daten werden als Mittelwert ± SE dargestellt. c, d HE-Färbung transplantierter Augenabschnitte 13, 26, 52 und 78 Wochen nach der Transplantation. Maßstabsbalken: 100 µm. e–h Immunfärbung transplantierter Augenabschnitte auf menschliche Kernmarker, Netzhautmarker und Ki67. Maßstabsbalken: 20 µm. e Immunfärbung für HuNu (grün), Recoverin (rot), Chx10 (weiß) und DAPI (blau). f Immunfärbung für menschliches Ku80 (grün), Ki67 (rot) und DAPI (blau). g Hochvergrößertes Bild der Immunfärbung des Transplantats (52 Wochen) mit Antikörpern für menschliches Ku80 (grün), Ki67 (rot) und DAPI (blau). Der Pfeil zeigt Ki67+- und Ku80+-Zellen an. h Prozentsätze der Ki67+- und Ku80+-Zellen unter den menschlichen Ku80+-Zellen. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt. INL innere Kernschicht.

Die histopathologische Analyse der Transplantate 13, 26, 52 und 78 Wochen nach der Transplantation ergab keine proliferativen oder bösartigen Merkmale wie Kernatypien (Abb. 5c, d). Anschließend wurden IHC-Analysen der Transplantate durchgeführt (Abb. 5e – h). Der Prozentsatz der proliferierenden menschlichen Zellen (Ki67+ und Ku80+) unter den menschlichen Zellen (Ku80+) betrug zu jedem Zeitpunkt <1 %, was auf eine sehr begrenzte Proliferation der Transplantatzellen hinweist (Abb. 5f, g, h)52,53. Es wurde festgestellt, dass sich Transplantatzellen in Photorezeptoren (Recoverin+ und HuNu+) und bipolare Zellen (Chx10+ und HuNu+) differenzieren (Abb. 5e). Insbesondere wurden die von iPSC-Q abgeleiteten Netzhautschichten > 1,5 Jahre nach der Transplantation verpflanzt, selbst unter der Xenotransplantationsbedingung.

In dieser Studie wurden keine Tumorentstehung und keine anderen nachteiligen Auswirkungen im Zusammenhang mit den von iPSC-Q abgeleiteten Netzhautschichten beobachtet.

Um zu untersuchen, ob konservierte Netzhautschichten in einem stark degenerierten Zustand eingepflanzt werden und sich in reife Photorezeptoren differenzieren können, führten wir eine Transplantationsstudie mit Modell-Nacktratten im Endstadium der Netzhautdegeneration durch, die ein mutiertes menschliches Rhodopsin-Transgen (SD-Foxn1 Tg(S334ter)3Lav-Nacktratten) trugen , RD-nackte Ratten im Folgenden)54,55. Von iPSC abgeleitete Netzhautschichten, die mit der RT-Konservierungsmethode 3–4 Tage lang gelagert wurden, wurden in RD-nackte Ratten im Alter von 20–30 Wochen subretinal transplantiert. 24–44 Wochen nach der Transplantation waren die PKCalpha+- und Recoverin+-Bipolarzellen von Wirt/Ratte noch vorhanden, wohingegen die Photorezeptoren von Wirt/Ratte zu diesem Zeitpunkt fast vollständig degeneriert waren (Abb. 6a und ergänzende Abb. 6a, Kontrollbereich). Menschliche Recoverin+- und Ku80+-Photorezeptoren wurden in die stark degenerierte Netzhaut der Ratte eingepflanzt, um Photorezeptor-Rosettenstrukturen zu bilden (Abb. 6a' und ergänzende Abb. 6b, c, d), was mit früheren Studien übereinstimmt8, 35, 36, 39.

a–j' Immunfärbung von Rattenaugen, denen iPSC-S17-abgeleitete Netzhautschichten transplantiert wurden. Die Netzhautschichten wurden in den subretinalen Raum von RD-nackten Ratten transplantiert. Die Netzhäute der Ratten wurden 263 Tage nach der Transplantation (341 Tage nach Beginn der Differenzierung) fixiert. a, a' Immunfärbung für menschliches Ku80 (grün), Recoverin (rot) und PKCalpha (weiß). Kontrollieren Sie den nicht transplantierten Bereich (a). Verpflanzter Bereich (a'). Pfeilspitzen in (a): menschliche Ku80−-, Recoverin+- und PKCalpha+-Bipolarzellen der Ratte. b–b" Immunfärbung für menschliches Ku80 (grün), S-Arrestin (rot) und Cone-Arrestin (weiß). Der umrahmte Bereich in (b) entspricht (b'). Starke Vergrößerung in (b') und höhere Vergrößerung in (b"). c–h'-Immunfärbung für Photorezeptormarker. NRL (grün), Recoverin (rot) und RXRG (weiß) in (c, c'). S-Opsin (grün) und L/M-Opsin (rot) in (d). GNAT1 (grün) und PRPH2 (rot) in (e, e'). GNAT2 (grün) und PNA (rot) in (f). Menschliches Ku80 (grün), Synaptophysin (rot) und PKCalpha (weiß) in (g–g"). Pfeilspitzen in (g', g"): Synaptophysin-positive Neuriten in keinem Kernraum. Menschliches Ku80 (grün), Calbindin (rot) und S-Arrestin (weiß) in (h, h'). Pfeilspitzen in (h'): Calbindin-positive Neuriten. i, i' Maximales Projektionsbild von Z-Stapeln, immungefärbt für menschliches Ku80 (grün), Recoverin (rot) und PKCalpha (weiß) in (i, i'). Beachten Sie, dass sich menschliche Ku80−- und PKCalpha+-Bipolarzellen in der Nähe der menschlichen Ku80+- und Recoverin+-Photorezeptoren befanden (Pfeilspitzen). j, j' Maximales Projektionsbild von Z-Stapeln, gefärbt für CtBP2 (grün), LRIT3 (rot) und PKCalpha (weiß). Hohe Vergrößerung in (j'). Beachten Sie, dass die Photorezeptor-Synapse-Marker CtBP2 und LRIT3 in der Nähe der Neuriten von bipolaren PKCalpha+-Stäbchenzellen exprimiert wurden. DAPI-Färbung (blau) in (a, a', b–b", c, d, e, e', f, g, g', h, i, j, j'). Maßstabsbalken: 100 µm in ( a, a', b), 10 µm in (b', b", c–j) und 1 µm in (j'). INL innere Kernschicht, GCL-Ganglienzellschicht.

Wir untersuchten die Reifung transplantierter Photorezeptoren weiter durch die Expression von Stäbchen-, Zapfen-, Außensegment- (OS), äußerer plexiformer Schicht (OPL) und synaptischen Markern. Die Photorezeptor-Rosetten enthielten sowohl S-Arrestin+-Stab-Photorezeptoren als auch Cone-Arrestin+-Zapfen-Photorezeptoren (Abb. 6b, b', b"). Die Photorezeptor-Rosetten enthielten auch NRL+-Stab-Vorläufer, RXRG+-Zapfen-Vorläufer und einige reife Zapfen-Photorezeptoren, die positiv für S- Opsin und L/M-Opsin (Abb. 6c, c', d). Stäbchen und Zapfen in den Photorezeptor-Rosetten waren positiv für Phototransduktionsmarker (GNAT1 und GNAT2) und OS-Marker (PRPH2 und PNA), was darauf hindeutet, dass Stäbchen und Zapfen gereift waren um OS-ähnliche Strukturen zu bilden (Abb. 6e, e', f). Synaptophysin+-Neuriten und Calbindin+-Horizontalzellen befanden sich um die menschlichen Photorezeptorrosetten, was darauf hinweist, dass die OPL-ähnliche Struktur gebildet wurde (Abb. 6g, g', g", h, h', Pfeilspitzen). Bilder mit höherer Vergrößerung zeigten, dass menschliche Recoverin+- und Ku80+-Photorezeptoren in direktem Kontakt mit PKCalpha+- und Ku80−-Wirts-/Ratten-Bipolarzellen standen (Abb. 6i, i', Pfeilspitzen). Wir beobachteten auch die Expression der präsynaptischen Photorezeptormarker CtBP2 (Ribeye) und LRIT3 an den Spitzen der bipolaren PKCalpha+-Dendriten (Abb. 6j, j'). Diese Ergebnisse zeigten, dass konservierte Netzhautschichten in immundefiziente Ratten mit schwerem RD-Modell eingepflanzt wurden, um sich in reife Photorezeptoren mit OS-ähnlichen und OPL-ähnlichen Strukturen zu differenzieren.

Um die Lichtreaktivität der Netzhautschichten zu demonstrieren, führten wir Ex-vivo-Elektrophysiologietests unter Verwendung eines Multi-Elektroden-Arrays (MEA) durch. Von iPSC-S17 abgeleitete Netzhautschichten wurden an den Differenzierungstagen 81–95 nach 3-tägiger RT-Konservierung in den subretinalen Raum von 12 RD-nackten Ratten im Alter von 20–30 Wochen transplantiert. Als altersentsprechende Kontrollen dienten nicht transplantierte Augen. Die Ratten wurden 8–9 Monate nach der Transplantation einer Ex-vivo-MEA-Analyse unterzogen, um die von retinalen Ganglienzellen (RGC) abgeleiteten Spike-Zählungen und die RGC-Lichtreaktionen wie zuvor beschrieben zu bewerten36,56. Es wurden Lichtreize mit drei Intensitäten (schwach, mittel, stark) angewendet und elektrophysiologische Aufzeichnungen unter drei Bedingungen durchgeführt: vor der Zugabe des metabotropen Glutamatrezeptor (mGluR6)-Blockers L-AP4 (vorher), nach der Zugabe von L-AP4 (L- AP4) und nach dem Auswaschen von L-AP4 (Nach dem Auswaschen) (Abb. 7a, b). Die Länge des transplantierten Bereichs betrug etwa 1,0–2,0 mm (Abb. 7b, rote Linie). Der transplantierte Bereich wurde auf den Elektroden montiert. Die Peri-Stimulus-Zeithistogramme der RGC-Spike-Zählungen ließen darauf schließen, dass durch Lichtreize induzierte RGC-Spikes in der transplantierten Netzhaut nachgewiesen wurden (Abb. 7c, oben). In einer repräsentativen Aufzeichnung (Abb. 7c, Kasten und Abb. 7d) wurden nach Einsetzen des Lichtreizes erhöhte RGC-Spitzenzahlen beobachtet (Abb. 7d, Vorher). Die Zugabe von L-AP4 schwächte die durch Lichtreiz induzierten RGC-Spitzen ab (Abb. 7c, d, L-AP4). Nach dem Auswaschen von L-AP4 traten durch Lichtreize induzierte RGC-Spitzen mit erhöhter Reaktionsfähigkeit wieder auf (Abb. 7d, nach dem Auswaschen). Im Gegensatz dazu wurden in den nicht transplantierten Kontrollnetzhäuten nur wenige durch Lichtreize induzierte RGC-Spitzen festgestellt (Abb. 7c, d, unten). Diese Ergebnisse zeigten, dass die RGC-Lichtreaktionen in den transplantierten Rattennetzhäuten von den transplantierten menschlichen Netzhautschichten herrührten und von der synaptischen Übertragung von transplantierten Photorezeptoren auf bipolare Zellen abhingen. Ähnliche RGC-Lichtreaktionen waren in 2 von 13 Augen erkennbar, denen nach RT-Konservierung iPSC-Q-abgeleitete Netzhautschichten transplantiert worden waren (ergänzende Abbildung 7a, b). Sogar iPSC-Netzhautblätter, die nach 4-tägiger RT-Konservierung transplantiert wurden, zeigten RGC-Lichtreaktionen (und ergänzende Abbildungen 7c, d).

ein Schema eines Ex-vivo-Elektrophysiologie-Assays unter Verwendung von MEA zur Bewertung der Lichtreaktionen in transplantierten iPSC-Netzhäuten. Von iPSC-S17 abgeleitete Netzhautschichten wurden in den subretinalen Raum in RD-nackte Ratten transplantiert. Zur elektrophysiologischen Aufzeichnung wurden transplantierte und nicht transplantierte Rattennetzhäute auf die MEA-Elektroden montiert. Während der Aufzeichnung wurden Lichtreize in unterschiedlichen Intensitäten (schwach, mittel, stark) durchgeführt und die Netzhäute der Ratten wurden in Ames-Medium inkubiert (Vorher), gefolgt von der Zugabe von L-AP4 (L-AP4) und dem Auswaschen von L -AP4 (Nach dem Auswaschen). b–d Repräsentative Ergebnisse der MEA-Analyse. (b) Differentialinterferenzkontrastbild (DIC) einer auf der MEA montierten Netzhaut einer RD-nackten Ratte. Der transplantierte Bereich wurde durch eine rote gepunktete Linie angezeigt. Maßstabsleiste: 1 mm. c, d Peri-Stimulus-Zeithistogramme zur Untersuchung der RGC-Spike-Anzahl bei starken Lichtstimuli (12,84 log Photonen/cm2/s). Die X-Achse und die Y-Achse stellen die Zeit bzw. die durchschnittliche RGC-Spike-Anzahl dar. Es werden Aufzeichnungsdaten für iPSC-S17-abgeleitete Netzhautblatt-transplantierte Rattennetzhäute (transplantiert; oben) und nicht transplantierte Rattennetzhäute (nicht transplantiert; unten) in den drei Bedingungen (Vor, L-AP4, Nach dem Auswaschen) angezeigt. Die Aufzeichnungsdaten mehrerer Elektroden sind in (c) dargestellt und repräsentative Daten (rotes Feld in c) sind in (d) dargestellt. Gelber Kasten in (c, d): Lichtreize. Rote Pfeile in (d): Startzeitpunkt der Lichtreize. e RGC-Lichtreaktionswahrscheinlichkeiten. Nicht transplantierte Kontrollnetzhäute von Ratten (Kontrolle; n = 12) und iPSC-S17-abgeleitete Netzhautblatt-transplantierte Rattennetzhäute (transplantiert; n = 12) wurden einer MEA-Analyse unterzogen, um die RGC-Reaktionen auf Lichtstimulation zu bewerten. Punkte und Balken zeigen die Zusammenfassung der gesammelten Daten pro Probe (aufgezeichnete Rattennetzhaut). Punkt: RGC-Lichtreaktionswahrscheinlichkeit, geschätzt durch statistische Modellierung (statistische Bayes-Inferenz mit Markov-Ketten-Monte-Carlo-Stichprobe). Balken: 89 %-Konfidenzintervall.

Um das funktionelle Potenzial der Netzhautschichten weiter zu bestätigen, verglichen wir die Wahrscheinlichkeit von RGC-Lichtreaktionen in nicht transplantierter (Kontrolle) und transplantierter Netzhaut. Die RGC-Anzahl mit auf Licht reagierenden Spitzen pro Anzahl der aufgezeichneten RGC (RGC-Lichtreaktionswahrscheinlichkeit) wurde mithilfe der Bayes'schen statistischen Inferenz wie beschrieben geschätzt56. In nicht transplantierten Netzhäuten von Ratten wurden selten starke RGC-Lichtreaktionen für schwache, mittlere und starke Lichtreize festgestellt (Abb. 7e, Kontrolle und vorher; 0 Lichtreaktionen in 12 Netzhäuten von Ratten, 0 %). In Netzhäuten von Ratten, denen iPSC-S17-abgeleitete Netzhautschichten transplantiert worden waren, wurden robuste RGC-Lichtreaktionen mit einer durchschnittlichen Reaktionswahrscheinlichkeit > 0,25 in zwei Netzhäuten von Ratten für mittelstarke bis starke Lichtreize beobachtet (Abb. 7e, Transplantiert und vorher; 2 Lichtreaktionen in 12 Rattennetzhäute, 17 %). Die erkannten RGC-Lichtreaktionen waren überwiegend vom ON-Typ, da sie in Gegenwart von L-AP4 eine Abschwächung zeigten (Abb. 7e, transplantiert und L-AP4) und nach dem Auswaschen von L-AP4 wieder auftraten (Abb. 7e, transplantiert und nach dem Auswaschen). . Beachten Sie, dass die RGC-Lichtreaktionen nach dem Auswaschen von L-AP4 verstärkt waren (Abb. 7e, Transplantation und nach dem Auswaschen im Vergleich zu Transplantation und davor), was mit der vorherigen Studie übereinstimmt56. Nach dem Auswaschen von L-AP4 wurden RGC-Lichtreaktionen in drei transplantierten Netzhäuten für schwache Lichtreize und sechs transplantierten Netzhäuten für mittlere bis starke Lichtreize beobachtet (Abb. 7e, Transplantiert und nach dem Auswaschen; 6 Lichtreaktionen in 12 Netzhäuten von Ratten, 50 %). Diese Ergebnisse zeigten, dass nach der RT-Konservierung transplantierte iPSC-Netzhautschichten RGC-Lichtreaktionsfunktionen aufwiesen (6 Lichtreaktionen in 12 transplantierten Rattennetzhäuten [50 %] gegenüber 0 Lichtreaktionen in 12 Kontrollrattennetzhäuten [0 %]) (Abb. 7e). .

Interessanterweise wurden RGC-Lichtreaktionen in Netzhautschichten beobachtet, die an den Differenzierungstagen 81–83 (n = 7) und 90–95 (n = 5) transplantiert wurden, was darauf hindeutet, dass die Netzhautschichten etwa am 80. und etwa 90. Tag das Potenzial für eine Verbesserung hatten Lichtreaktionen bei Modellratten zur Netzhautdegeneration und dass der zulässige Bereich der Differenzierungstage für die Wirksamkeit groß sein kann (ergänzende Abbildung 8a). Darüber hinaus wurden RGC-Lichtreaktionen in transplantierten Augen sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen RD-nackten Ratten beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Transplantation der Netzhautschicht die RGC-Lichtreaktionen sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Tieren verstärkte (ergänzende Abbildung 8b).

Zusammengenommen zeigten die Wirksamkeitsstudien, dass von iPSC abgeleitete Netzhautschichten, die 3–4 Tage lang bei 17 °C konserviert wurden, das Potenzial hatten, sich in die stark degenerierten Netzhäute von RD-nackten Ratten einzupflanzen und auszureifen, um die von ex gemessenen RGC-Lichtreaktionsfunktionen aufzuweisen Vivo-Elektrophysiologie-Assays. Diese Sicherheits- und Wirksamkeitsstudien an den Netzhautschichten zeigten, dass die QC- und RT-Konservierungsmethoden für die Erzeugung transplantierbarer Netzhautschichten sinnvoll waren (ergänzende Abbildung 9).

Die selbstorganisierende Stammzellkulturtechnologie ermöglicht die Erzeugung von 3D-Geweben und Organoiden in einer Schale1. Die selbstorganisierte Gewebe-/Organoidtransplantation ist ein attraktiver Ansatz für die regenerative Medizin bei Netzhautdegeneration. Frühere Studien haben gezeigt, dass hPSC-Netzhautschichten 0,5–2 Jahre lang in Modellnagetiere und nichtmenschliche Primaten im Endstadium der Photorezeptor-Degeneration eingepflanzt wurden8,35,36,37,39,57. Die wichtigsten verbleibenden Technologien für die Gewebe-/Organoidtransplantation waren eine QC-Strategie und eine Konservierungsmethode. In dieser Studie haben wir eine QC-Strategie für von hPSC abgeleitete Netzhautschichten entwickelt. Netzhautgewebe in Kultur bildet von selbst eine einzigartige morphologische Struktur, die unter dem Mikroskop leicht zu unterscheiden ist, und daher können Netzhautschichten präpariert werden. Um mögliche Fehler bei der Auswahl des Netzhautgewebes und die Vermeidung von Off-Target-Geweben auszuschließen, haben wir die wichtigsten Off-Target-Gewebe charakterisiert und den Ring-PCR-Test entwickelt. Netzhautgewebe mit seiner großen kontinuierlichen neuroepithelialen Struktur kann in zwei Gewebeschichten zerlegt werden: die innere zentrale Schicht (Kappe) und die äußere periphere Schicht (Ring) mit ähnlichen Genexpressionsmustern. Somit kann die qPCR-Analyse des Rings verwendet werden, um die Genexpression im entsprechenden Cap abzuschätzen. Da der Ring-PCR-Test 1–2 Tage dauert, haben wir die RT-Konservierungsmethode entwickelt, um Netzhautschichten für mindestens 3–4 Tage aufzubewahren. Um die Gründe für die QC-Strategie und die RT-Konservierungsmethode zu demonstrieren, führten wir In-vivo-Tumorigenitäts- und präklinische Wirksamkeitsstudien durch. In der Tumorigenitätsstudie wurden keine Tumoren oder andere nachteilige Auswirkungen im Zusammenhang mit den iPSC-abgeleiteten Netzhautschichten beobachtet. Die präklinische Wirksamkeitsstudie zeigte, dass konservierte Netzhautschichten das Potenzial hatten, sich im stark degenerierten Zustand zu verpflanzen und zu reifen, und Lichtreaktionsfunktionen aufwiesen, die durch Ex-vivo-Elektrophysiologietests gemessen wurden. Diese präklinischen Studien unterstützen das Konzept der iPSC-abgeleiteten Netzhautblatttransplantation zur Behandlung von Netzhautdegeneration.

Basierend auf aktuellen und früheren Studien5,6,7,8,27,33,34,35,36,37,38,39 beantragte das Kobe City Eye Hospital klinische Forschung für eine begrenzte Anzahl von Patienten, die iPSC-abgeleitete Netzhautfolien verwenden Retinitis pigmentosa. Im Juni 2020 wurde der klinische Forschungsplan vom Health Science Council des japanischen Ministeriums für Gesundheit, Arbeit und Soziales genehmigt und mit der klinischen Forschung begonnen (Studien-ID: jRCTa050200027). Sumitomo Pharma entwickelte einen Herstellungsprozess in klinischer Qualität und erzeugte allogene iPSC-abgeleitete Netzhautschichten in klinischer Qualität. In den Jahren 2020–2021 wurden bei zwei Patienten iPSC-Netzhautschichten transplantiert.

Die vorliegende Studie basiert auf einer hocheffizienten und robusten selbstorganisierenden Kulturtechnologie. Die Kombination von SFEBq-, BMP-, Vorkonditionierungs- und Induktionsumkehrmethoden ermöglicht eine robuste selbstorganisierende 3D-Differenzierungskultur für die Erzeugung von Netzhautgewebe mit einem großen kontinuierlichen Neuroepithel7,8. Diese große, kontinuierliche Neuroepithelstruktur hatte in tangentialer Richtung eine Größe von 1–3 mm und war unter dem Mikroskop leicht zu erkennen, sodass die Kappe und der Ring präpariert werden konnten. Das selbstorganisierte Netzhautgewebe mit kontinuierlichem Neuroepithel differenzierte sich reproduzierbar zu einer mehrschichtigen Struktur mit Crx+-Photorezeptor-Vorläufer- und Chx10+-Netzhaut-Vorläuferzellschichten aus mehreren hPSC-Linien unter Verwendung unserer Protokolle oder verschiedener Kulturprotokolle6,12,13,14,18,19,22. Dieses Merkmal der 3D-Selbstorganisation, das möglicherweise auf dem intrinsischen Embryonalentwicklungsprogramm basiert, ist die Kerntechnologie für die robuste Erzeugung von Netzhautschichten mit kontrollierter Qualität.

Eines der Merkmale der QC-Methode in der vorliegenden Studie war die Zerlegung und Analyse des Rings, um die Qualität der Kappe zu überprüfen. Dieser Cap-and-Ring-Ansatz könnte für andere Organoide mit einem kontinuierlichen Epithel verwendet werden, wie z. B. kortikale, Hippocampus-, Hypophysen- und Darmorganoide40,58,59,60. Obwohl die manuelle Dissektion winziger Gewebe ein vorherrschendes experimentelles Verfahren in der Forschung ist, bei dem frühe Xenopus-Embryonen oder sich entwickelnde Gehirne von Mäusen für die Kultur primärer neuronaler Vorläuferzellen verwendet werden33,39, wird die Automatisierung und Mechanisierung des Dissektionsprozesses für die zukünftige Herstellung von iPSC-abgeleiteten Netzhautschichten wichtig sein.

Um die Qualität des Rings zu untersuchen, war ein möglicher QC-Test die qPCR-Analyse und die anderen waren IHC-Analyse, Durchflusszytometrie, Genchip-Analyse (Microarray), RNA-seq und Einzelzellanalyse. Wir haben uns in dieser Studie für qPCR entschieden, weil es Hochdurchsatz-Assays zum Testen vieler Proben in relativ kurzer Zeit ermöglicht, eine hohe Empfindlichkeit aufweist und technisch einfach ist48. Auch die anderen QC-Tests hatten Stärken. Eine kürzlich durchgeführte Studie mit dem RNA-seq-Ansatz ergab, dass Six6-negative Off-Target-Zellen in einer Netzhautdifferenzierungskultur unter Verwendung der Matrigel-Methode mehrere neurale Zellen enthalten, darunter Emx2-positive Zellen und HoxB2-positive Zellen61. Darüber hinaus sind Einzelzellanalysen wie Einzelzell-RNA-Seq leistungsstarke Technologien, und mehrere Gruppen haben über bahnbrechende Studien berichtet13,62,63,64,65. Mittlerweile sind Bildgebungstechnologien und computergestützte Bildverarbeitung, wie beispielsweise Deep-Learning-Technologien, vielversprechende Ansätze für die Entwicklung zerstörungsfreier QC-Tests. In zukünftigen Studien möchten wir mit der Einzelzellanalyse und Bildgebungstechnologie fortfahren, um die Qualität der selbstorganisierenden 3D-Netzhäute weiter zu untersuchen.

Obwohl die Kryokonservierung ein attraktiver Ansatz für die weltweite Versorgung ist, zeigten kryokonservierte Netzhautschichten eine beeinträchtigte Transplantation. Daher mussten wir eine Methode zur gefrierfreien Konservierung entwickeln und stellten fest, dass die optimale Temperatur für die Konservierung der Netzhautschicht nahezu Raumtemperatur (17 ± 5 °C) betrug. Für Lebergewebe wurde über eine Konservierung bei Raumtemperatur berichtet49, und unsere Studie zeigte, dass eine Temperatur nahe der Raumtemperatur für Nervengewebe wie Netzhautgewebe geeignet ist. Niedrige Temperaturen um 4 °C führten zu Gewebeschäden, möglicherweise durch einen abnormalen intrazellulären Stoffwechsel bei 4 °C49. Eine Kultur bei 37 °C und 5 % CO2 war für das Zellwachstum geeignet, aber die Morphologie der Netzhautschichten veränderte sich während der selbstorganisierenden Kultur. Durch RT-Konservierung bei 17 ± 5 °C könnte die Morphologie der Netzhautschichten erhalten bleiben. Während der RT-Konservierung wird das Netzhautgewebe angehalten, um in die S-Phase einzutreten, was die Möglichkeit erhöht, dass die Proliferation unter dieser Konservierungsbedingung unterbrochen wird. Kürzlich wurde über RT-Konservierung für RPE und Netzhautgewebe berichtet66,67. Wir haben eine RT-Konservierungsmethode entwickelt und Transplantationsstudien, einschließlich einer 1,5-jährigen Studie zur Tumorigenität, für Netzhautschichten unter der RT-Konservierungsbedingung durchgeführt.

Im Hinblick auf klinische Anwendungen haben wir die In-vivo-Tumorgenität und Wirksamkeit von iPSC-Netzhautschichten bewertet, die mithilfe des Ring-PCR-Tests und der RT-Konservierungsmethode erzeugt wurden. In der Tumorigenitätsstudie wurden keine Tumoren oder andere schädliche Auswirkungen im Zusammenhang mit der Netzhautschicht beobachtet. RT-konservierte iPSC-Netzhautschichten wurden in RD-nackte Ratten eingepflanzt und reiften zu Photorezeptor-Rosetten. Ähnliche Photorezeptor-Rosettenstrukturen wurden bei der Transplantation von fetalem Netzhautgewebe von menschlichen Spendern bei Ratten beobachtet68. Obwohl die Hälfte der menschlichen iPSC-Photorezeptoren in Rosetten auf der RPE-Seite des Wirts weit von den bipolaren Zellen des Wirts/der Ratte entfernt waren, konnte die andere Hälfte der menschlichen iPSC-Photorezeptoren in Rosetten auf der RGC-Seite des Wirts mit den bipolaren Zellen des Wirts/der Ratte in Kontakt kommen. Eingepflanzte iPSC-Photorezeptoren reiften in vivo, um die OS-ähnliche Struktur auf der inneren apikalen Oberfläche der Rosetten und die OPL-ähnliche Struktur mit Photorezeptor-Synapsenmarker-Expression auf der äußeren Basalseite neben bipolaren Zellen und horizontalen Zellen zu bilden. Die Elektronenmikroskopie wird ein Schlüssel zur Demonstration der synaptischen Verbindungen zwischen transplantierten Photorezeptoren und bipolaren Wirtszellen sein. Wichtig ist, dass 50 % der iPSC-Netzhauttransplantationen Lichtreaktionen zeigten, die durch Ex-vivo-MEA-Aufzeichnungen überwacht wurden. Diese Rate war vergleichbar mit früheren Ergebnissen für die Transplantation frischer iPSC-Netzhäute ohne RT-Konservierung (4 Lichtreaktionen in 7 transplantierten Rattenaugen, 57 %)36. Diese Beobachtungen zeigten, dass RT-konservierte iPSC-Netzhautschichten, die im Endstadium der Netzhautdegeneration transplantiert wurden, eingepflanzt und in reife Photorezeptoren differenziert wurden und RGC-Lichtreaktionen zeigten. In zukünftigen Studien wird es interessant sein, die Lichtreaktivität von RT-konservierten Netzhautschichten im Gehirn und die Verhaltensebenen zu untersuchen37.

Für zukünftige klinische Anwendungen bei einer großen Anzahl von Patienten werden weitere präklinische Studien von entscheidender Bedeutung sein. Unter anderem sind die großen Tierstudien zur Entwicklung chirurgischer Verfahren, Transplantationsgeräte und Immunsuppressionsprotokolle wichtig, um eine weit verbreitete Verwendung von Netzhautschichten zu ermöglichen. Basierend auf der selbstorganisierenden Stammzellkulturtechnologie schreitet die Umsetzung der Gewebe-/Organoidtherapie in der Medizin voran.

Zwei menschliche iPSC-Linien, iPSC-LPF11 und iPSC-S17, wurden aus peripheren Blutzellen unter Verwendung von Sendai-Virus-Vektoren von Sumitomo Pharma8 etabliert. Die iPSC-QHJI01s04-Linie (iPSC-Q) wurde durch das iPSC Stock Project entwickelt, das vom Kyoto University Center for iPS Cell Research and Application (CiRA) organisiert und von der Kyoto University69,70 bereitgestellt wurde. Die an der Universität Kyoto etablierte und von ePBMC(R) abgeleitete iPSC-1231A3-Linie, die von Cellular Technology Limited (http://www.immunospot.com/) erworben wurde, wurde von der Universität Kyoto bereitgestellt41. Die Versuchsprotokolle mit menschlichen iPSCs klinischer Qualität wurden von der Forschungsethikkommission von Sumitomo Pharma Co., Ltd., Japan, genehmigt.

Die Feeder-freien hPSC-Kultur-, SFEBq-, Vorkonditionierungs-, d0-SAG-, BMP- und Induktionsumkehrkulturmethoden wurden wie beschrieben6,7,8,41 mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. In Prozess 1 (Erhaltungskultur) wurden menschliche iPSCs auf LM511-E8-Matrix (Nippi) in StemFit-Medium (Ajinomoto) gemäß einem veröffentlichten Protokoll41 mit geringfügigen Änderungen8 gehalten. Das Medium wurde alle 1–2 Tage gewechselt, bis die Zellen eine Konfluenz von 70–80 % erreichten. iPSCs wurden mit TrypLE Select Enzyme (Thermo Fisher Scientific) passagiert und durch vorsichtiges Pipettieren in einzelne Zellen dissoziiert. Die dissoziierten iPSCs wurden mit einer Dichte von 700–1700 Zellen/cm2 ausgesät und in mit LM511-E8-Matrix beschichteten Kulturplatten mit sechs Vertiefungen (Iwaki) kultiviert, die StemFit-Medium mit 10 µM Y-27632 (Wako)8 enthielten. Vor der Differenzierung wurden iPSCs als Vorkonditionierungsschritt mit SB431542 (SB; Wako) und/oder Smoothened Agonist (SAG; Enzo Biochem) behandelt.

In Prozess 2 (Netzhautdifferenzierung) wurden hPSCs 4–7 Minuten lang bei 37 °C mit TrypLE Select Enzyme behandelt und durch vorsichtiges Pipettieren in einzelne Zellen dissoziiert. Die dissoziierten iPSCs wurden unter Verwendung von 96-Well-Platten mit geringer Zelladhäsion und V-Boden-Wells (Sumilon PrimeSurface-Platten; Sumitomo Bakelite) in Differenzierungsmedium (gfCDM+KSR) mit Y-27632 und SAG (d0-SAG-Methode) schnell wieder aggregiert. Das Differenzierungsmedium war gfCDM, ergänzt mit 10 % KSR, während gfCDM allein 45 % Iscoves modifiziertes Dulbecco-Medium (Gibco), 45 % Hams F12 (Gibco), Glutamax, 1 % chemisch definiertes Lipidkonzentrat (Gibco) und 450 µM Monothioglycerin enthielt ( Sigma-Aldrich). Der Tag des Beginns der SFEBq-Kultur wurde als Tag 0 definiert. Am Tag 3 wurde rekombinantes menschliches BMP4 (R&D Systems) in einer Menge von 1,5 nM (55 ng/ml)7 hinzugefügt. Danach wurde das Kulturmedium alle 3–4 Tage gewechselt, um unreifes Netzhautgewebe zu erzeugen.

In Prozess 3 (Induktionsumkehrkultur) wurde das aus iPSCs erzeugte unreife Netzhautgewebe wie folgt einer zweistufigen Induktionsumkehrkultur unterzogen. Für die Induktionskultur wurden Zellaggregate an den Tagen 14–18 von 96-Well-Platten in 90-mm-Petrischalen ohne Zelladhäsion (Sumitomo Bakelite; ca. 32–48 Aggregate/90-mm-Schale) überführt und 3 Jahre lang kultiviert Tage in DMEM/F12-Glutamax-Medium (Gibco), das 1 % N2-Ergänzung (Gibco), 3 µM CHIR99021 (GSK3-Inhibitor; Wako) und 5 µM SU5402 (FGFR-Inhibitor; Wako) enthält. Für die Umkehrkultur (Prozess 3) und die Reifungskultur (Prozess 4) wurden die Zellaggregate wie beschrieben in Retina-Reifungsmedium kultiviert (Nukaya et al. WO2019017492A1, WO2019054514A1). Um 3D-Netzhäute zu erhalten, wurde das Medium jeden dritten oder vierten Tag gewechselt. Schwimmende Zellaggregate wurden mit einem Umkehrmikroskop (Keyence BZ-X810, Nikon Eclipse-Ti oder Olympus IX83) analysiert.

Jedes Zellaggregat, das kontinuierlich geschichtetes neuroepitheliales Gewebe enthielt, wurde einer Dissektion der Kappe und des Rings unterzogen (Prozess 5). Der zentrale Teil des Neuroepithelgewebes wurde wie beschrieben unter einem Mikroskop aus dem Zellaggregat herausgeschnitten39. Die präparierte innerzentrale neuroepitheliale Gewebeschicht wurde als Kappe gesammelt. Gleichzeitig wurde der umgebende äußere periphere Teil des Neuroepithelgewebes aus dem Zellaggregat herausgeschnitten und als Ring geerntet. Die erhaltenen Kappen und Ringe wurden der RT-Konservierungsmethode bzw. dem Ring-qPCR-Test unterzogen. Kappen, deren Ringe den Ring-PCR-Test bestanden, wurden als Netzhautschichten für die Transplantation verwendet.

Ringe und andere Gewebeproben wurden mit Puffer RLT (Qiagen), der 1 % 2-Mercaptoethanol enthielt, lysiert und die Gesamt-RNA wurde mit einem RNeasy Micro Kit (Qiagen) extrahiert und gereinigt. Die Gesamt-RNA wurde revers transkribiert und einer qPCR unter Verwendung eines StepOne Plus Real-Time PCR-Systems (Applied Biosystems) oder Biomark HD (Fluidigm) gemäß den Anweisungen des Herstellers unterzogen. Basierend auf den Ct-Werten für jedes Gen wurden Z-Scores für die einzelnen Kappen oder Ringe berechnet. Die Daten wurden mithilfe der Heatmap.2-Funktion des R/Bioconductor-Pakets gplots als Heatmaps visualisiert. PCA wurde mit der prcomp-Funktion im R-Basispaket durchgeführt. Die PCA-Ergebnisse wurden mit dem R-Paket ggplot2 visualisiert. Die folgenden qPCR-Primer (TaqMan-Sonden) wurden von Applied Biosystems, Inc. gekauft und für die qPCR-Analyse verwendet: GAPDH (Hs02758991_g1), ACTB (Hs01060665_g1), Sox2 (Hs01053049_s1), Pax6 (Hs00240871_m1), Rx (Hs00429459_m1), Chx1 0 (Hs01584047_m1 ), Recoverin (Hs00610056_m1), Blimp1 (Hs00153357_m1), NRL (Hs00172997_m1) _m1), HoxB2 (Hs01911167_s1) und Lin28a (Hs00702808_s1).

Präparierte Gewebe in den Zellaggregaten wurden mit Puffer RLT (Qiagen), der 1 % 2-Mercaptoethanol enthielt, lysiert und die Gesamt-RNA wurde mit einem RNeasy Micro Kit (Qiagen) extrahiert und gereinigt. Die Microarray-Analyse unter Verwendung eines GeneChip-Arrays wurde von Kurabo Industries (Osaka, Japan) durchgeführt. Kurz gesagt, die Gesamt-RNA wurde mit dem T7-Oligo-d(T)-Primer (Affymetrix) revers in cDNA transkribiert. Als nächstes wurde Biotin-markierte cRNA synthetisiert und durch In-vitro-Transkription der Zweitstrang-cDNA-Matrize unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase (Affymetrix) amplifiziert. Die markierte cRNA wurde gereinigt und fragmentiert, auf ein GeneChip® Human Genome U133 Plus2.0-Array (Affymetrix) geladen und gemäß dem Protokoll des Herstellers hybridisiert. Rohintensitätsdaten vom GeneChip-Array wurden mit der GeneChip Operating Software (Affymetrix) analysiert. Die Daten wurden logarithmisch transformiert und logFC für jedes Gen berechnet. Die logFC-Daten wurden mithilfe der Heatmap.2-Funktion des R/Bioconductor-Pakets gplots als Heatmaps visualisiert.

Kappen und Ringe wurden aus 3D-Netzhäuten präpariert. Die Kappe, deren Ring den Ring-PCR-Test bestanden hat, wurde einer scPCR-Analyse unterzogen. Die Kappe wurde unter Verwendung von Papain (Wako) in einzelne Zellen dissoziiert und anschließend zur Einzelzellisolierung in den C1-Vorverstärker IFC (10–17 μm, Fluidigm) geladen. Die Voramplifikation der Gene wurde im C1-Gerät (Fluidigm) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die voramplifizierten cDNAs jeder Zelle wurden unter Verwendung des Biomark HD-Instruments (Fluidigm) mit den TaqMan-Assays weiter amplifiziert.

Zellaggregate und Gewebeschichten (Kappen) wurden in 1,5-ml- oder 15-ml-Röhrchen überführt. Nach dem Auswaschen des Kulturüberstands wurde Konservierungslösung zugegeben und die Röhrchen in Inkubatoren gestellt, die auf 4, 12, 15, 17, 20, 22 und 37 °C eingestellt waren. Zur Temperaturvalidierung wurden in einigen Experimenten die Temperaturen der Inkubatoren durch Temperaturlogger überwacht. Als mögliche Konservierungslösungen wurden Optisol-GS (Bausch & Lomb), Balanced Salt Solution (BSS) (Gibco), Belzer UW Cold Storage Solution (Bridge to Life) und Zellkulturmedien verwendet. Zur RT-Konservierung der Verschlüsse wurde jedes 1,5-ml-Röhrchen mit einem Verschluß in Optisol in einen Kühlinkubator (Mitsubishi Electric Engineering) gestellt, der auf 17 °C eingestellt war. Kappen, die die QC-Tests, einschließlich des Ring-PCR-Tests, bestanden, wurden abgeholt und für die Transplantation verwendet.

Gewebeschichten, die aus 3D-Netzhäuten präpariert wurden, wurden unter Verwendung von Papain (Wako) in einzelne Zellen dissoziiert. Nach Zentrifugation und Entfernung der Überstände wurden die dissoziierten Zellen in frischem Medium suspendiert. Gesamtzellen und tote Zellen wurden mit Acridinorange und DAPI gefärbt und die Anzahl und der Prozentsatz lebensfähiger Zellen wurden mit NucleoCounter® NC-200 (ChemoMetec) bestimmt.

Alle Tierversuchsprotokolle wurden vom Tierpflegeausschuss des RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research (BDR) genehmigt und in Übereinstimmung mit der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research durchgeführt. SD-Foxn1 Tg(S334ter)3Lav-Nacktratten (RD-Nude-Ratten) wurden vom Rat Resource and Research Center54,55 erhalten. Die Transplantation in den subretinalen Raum von Ratten wurde wie beschrieben durchgeführt36. Sowohl männliche als auch weibliche RD-nackte Ratten, denen iPSC-Netzhautschichten transplantiert worden waren, wurden für MEA-Aufzeichnungen im Alter von 13,5–15 Monaten (dh 8–10,5 Monate nach der Transplantation) verwendet. Die MEA-Aufzeichnungen wurden mit dem USB-MEA60-Up-System (Mehrkanalsysteme) wie beschrieben durchgeführt36,56. Kurz gesagt, RD-nackte Ratten wurden vor der Verwendung 1–3 Tage lang an die Dunkelheit angepasst. Die Ratten wurden durch übermäßige Inhalation von Isofluran oder Sevofluran betäubt und getötet. Ihre Augenmuscheln wurden dann unter schwachem Rotlicht mit einer Spitzenwellenlänge von 700 nm geerntet und im Dunkeln in sauerstoffhaltiges Ames-Medium (Sigma-Aldrich) gelegt. Die Netzhaut wurde sorgfältig von der Augenmuschel isoliert und der restliche Glaskörper entfernt. Die Netzhaut wurde mit der RGC-Seite nach unten montiert. Der transplantierte Bereich wurde an seinem gepunkteten Erscheinungsbild erkannt und auf der Elektrode zentriert. Vollfeld-Lichtstimuli mit 10 ms und 1 Sekunde Dauer bei unterschiedlichen Intensitäten (schwach: 10,56 log Photonen/cm2/s; mittel: 12,16 log Photonen/cm2/s; stark: 12,84 log Photonen/cm2/s) wurden mit a erzeugt weiße LED (NSPW500C; Nichia Corp.). Jeder Stimulationssatz, bestehend aus 3 Wiederholungen für jede Kombination aus Stimulationsintensität und -dauer, wurde vor der Zugabe von L-AP4 (Vorher) in Gegenwart von 10 μM L-AP4 (L-AP4, mGluR6-Blocker, Wako) wiederholt nach dem Auswaschen von L-AP4 (Nach dem Auswaschen). Am Ende der MEA-Aufzeichnungen wurden superstarke Reize (15,48 log Photonen/cm2/s) angewendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen in der Netzhaut zu bestätigen. Die MEA-Daten wurden mit einer Abtastrate von 20 kHz ohne Filterung erfasst. Die aufgezeichneten Spikes wurden offline sortiert, um RGC-Spikes zu zählen, wobei der automatische Vorlagenbildungs- und Spike-Matching-Algorithmus in Spike 2 (Version 7.2; CED) mit geringfügigen Änderungen verwendet wurde56. RGC-Lichtreaktionen wurden als eine zweifache Erhöhung der Spike-Frequenz gegenüber dem Stimulationsbeginn und/oder -versatz definiert. Die durchschnittliche RGC-Spike-Anzahl und die durchschnittliche RGC-Lichtreaktionswahrscheinlichkeit (RGC-Anzahl mit auf Licht reagierenden Spikes pro Anzahl aufgezeichneter RGC) wurden aus allen erkannten RGCs in jeder Probe wie beschrieben berechnet36,56.

Eine In-vivo-Studie zur Tumorentstehung an Tieren wurde vom IRB der Foundation for Biomedical Research and Innovation (FBRI), dem Ausschuss für Tierversuche des FBRI und dem Tierpflegeausschuss des RIKEN BDR genehmigt. Im RIKEN BDR wurde eine subretinale Transplantation durchgeführt. In dieser Studie wurden weibliche Nacktratten verwendet, um Kämpfe zwischen Ratten, die im selben Käfig gehalten wurden, zu reduzieren71. Sechs Wochen alte weibliche Nacktratten (F344/NJcl-rnu/rnu-Ratten; CLEA Japan) wurden für die Transplantation verwendet und während des Beobachtungszeitraums einer Beobachtung ihres Allgemeinzustands und Gewichtsmessungen unterzogen. Der chirurgische Stress einer subretinalen Transplantation bei Ratten wurde an scheinoperierten Augen bewertet (ergänzende Abbildung 5e, f). Fundusbildgebung und OCT-Analyse wurden mit RS-3000 Advance (Nidek) und Micron IV und OCT (Phoenix Research Labs) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Nach der Autopsie wurden die Augäpfel bei 4 °C in SUPERFIX (KY-500; Kurabo Japan) fixiert, in Paraffin eingebettet und mit einem Mikrotom in 3 µm Dicke geschnitten. Einer von fünf Schnitten wurde für die HE-Färbung und histopathologische Analyse verwendet, die anderen Schnitte wurden für die Immunhistochemie verwendet.

Die IHC wurde wie beschrieben durchgeführt8. Zellaggregate und transplantierte Netzhäute von RD-nackten Ratten wurden mit 4 % Paraformaldehyd (Wako) fixiert und mit einem Kryostat (Leica) geschnitten, um Gefrierschnitte herzustellen. Gefrierschnitte und Paraffinschnitte wurden mit oder ohne wärmebasierter Antigengewinnung in Target Retrieval-Lösung (Dako) 15 Minuten lang bei 105 °C behandelt. Die verwendeten Primärantikörper waren wie folgt: Anti-Chx10 (Schaf; 1:500; Exalpha), Anti-Pax6 (Maus; 1:1000; BD Biosciences), Anti-Rx (Meerschweinchen; 1:2000; Takara), Anti -Crx (Kaninchen; 1:200; Takara), Anti-Recoverin (Kaninchen; 1:500; Proteintech), Anti-RXRG (Maus; 1:500; Santa Cruz Biotechnology), Anti-NRL (Ziege; 1:500; R&D Systems), Anti-Lhx2 (Kaninchen; 1:500; Millipore), Anti-Rhodopsin (Maus; 1:1000; Sigma Aldrich), Anti-S-Opsin (Ziege; 1:1000; Santa Cruz Biotechnology), Anti- S-Opsin (Kaninchen; 1:500; Santa Cruz Biotechnology), Anti-L/M-Opsin (Kaninchen; 1:500; Millipore), Anti-Cone-Arrestin (Arrestin-3; Ziege; 1:500; Novus) , Anti-S-Arrestin (Maus; 1:500; Novus), Anti-CtBP2 (Maus; 1:500; BD Biosciences), Anti-PKCalpha (Ziege; 1:500; R&D Systems), Anti-Ki67 (Maus; 1:500; BD Biosciences), Anti-Aqp1 (Aquaporin1; Kaninchen; 1:500; Millipore), Anti-Emx2 (Schaf; 1:100; R&D Systems), Anti-gespaltene Caspase-3 (Kaninchen; 1:200; Cell Signaling Technology), Anti-HuNu (Maus; 1:500; Millipore), Anti-Human Ku80 (Kaninchen; 1:500; Cell Signaling Technology), Anti-Human Ku80 (Ziege; 1:500; R&D Systems), Anti-Mücke1 (Kaninchen; 1:500; Santa Cruz Biotechnology), Anti-Mücke2 (Kaninchen; 1:500; Santa Cruz Biotechnology), Anti-PRPH2 (Maus; 1:500; Millipore), Erdnuss-Agglutinin (PNA) (1:500; Thermo Fisher Scientific), Anti-Synaptophysin (Ziege; 1:500; R&D Systems) und Anti-LRIT3 (Kaninchen; 1 :500; Novus). Die nukleare Gegenfärbung wurde mit DAPI (Nacalai) durchgeführt. Gefärbte Schnitte wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Keyence BZ-X810) oder einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (Olympus Fluoview FV1000D, Leica TCS SP-8 oder Carl Zeiss LSM880) analysiert. Bildanalysen wurden mit der Bildgebungssoftware IMARIS (Oxford Instruments), ImageJ (National Institutes of Health) und Zen Blue (Carl Zeiss) durchgeführt.

Kontrollieren Sie für die EdU-Kennzeichnung die Netzhäute vor der Konservierung (d70 + 0), die Netzhäute, die in Optisol bei 17 °C für 2 Tage (d70 + 2) und 4 Tage (d70 + 4) konserviert wurden, und die Netzhäute, die in Kultur bei 37 °C für 3 Tage erholt wurden Tage (d70 + 4 + 3) und 7 Tage (d70 + 4 + 7) wurden 4 Stunden lang mit dem Thymidin-Analogon EdU behandelt. Die mit EdU behandelten Netzhäute wurden fixiert und mit einem Kryostat (Leica) geschnitten. Abschnitte der Netzhaut wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers mit Alexa Fluor 488-markiertem Azid (Invitrogen) gefärbt. Die Bilder wurden mit einem konfokalen Lasermikroskop aufgenommen und die Anzahl der EdU-positiven Zellen und DAPI-positiven Kerne wurde mit der ImageJ-Software (National Institutes of Health) gezählt.

Statistische Analysen wurden mit R Version 3.6.0 (The R Foundation for Statistical Computing) durchgeführt. Für Vergleiche mit zwei Gruppen wurde ein zweiseitiger Student-t-Test durchgeführt, und für Vergleiche mit mehreren Gruppen wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von einem Tukey-Test durchgeführt. Unterschiede zwischen den Gruppen im Körpergewicht und in der Überlebensrate wurden durch eine einfache ANOVA bzw. den Log-Rank-Test getestet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle angemessenen Anfragen werden umgehend von den leitenden Autoren geprüft, um festzustellen, ob die Anfrage irgendwelchen geistigen Eigentums- oder Vertraulichkeitsverpflichtungen unterliegt. Diese Studie generierte keine neuen Zelllinien. Quelldaten für Diagramme werden als Zusatzdaten bereitgestellt. Microarray-Transkriptomdaten sind unter der Zugangsnummer GSE197446 verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Wir danken der CiRA (Kyoto, Japan) und der CiRA Foundation (Kyoto, Japan) für die freundliche Bereitstellung von iPSCs. Wir danken Dr. Mototsugu Eiraku für Ratschläge zur Reifungskultur der Netzhaut sowie Yasushi Hiramine, Miki Iwata, Kazunari Tanaka, Masahiro Yahata, Koichiro Manabe, Kiyoko Bando, Jiro Akimaru, Keigo Kawabe, Kenji Yoshida, Satoshi Ando, ​​Atsushi Tsuchida, Tomokazu Nagano, und Mitgliedern von RACMO für fruchtbare Diskussionen. Wir danken Ayumi Kiso für In-vivo-Studien, Kohei Kanata für die IHC-Färbung und Yukiko Ishigami für die Sektion. A.Ku. möchte seinem verstorbenen Mentor Dr. Yoshiki Sasai, einem begabten Wissenschaftler, der Pionierarbeit in der selbstorganisierenden Stammzellbiologie geleistet hat, seinen tiefen Dank aussprechen. Diese Arbeit wurde vom Research Center Network for Realization of Regenerative Medicine der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (MT, SK) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Kenji Watari, Suguru Yamasaki.

Regenerative & Cellular Medicine Kobe Center, Sumitomo Pharma Co., Ltd., Chuo-ku, Kobe, 650-0047, Japan

Kenji Watari, Suguru Yamasaki, Tatsuya Kamei, Yasuyuki Kita, Masayo Fujiwara, Yoriko Hori, Anna Tanabe, Rina Hirai, Orie Terai, Osamu Ohno, Hidetaka Ohara, Tetsuya Hayama, Atsushi Ikeda, Daiki Nukaya, Keizo Matsushita, Akiyoshi Kishino, Toru Kimura & Atsushi Kuwahara

Labor für Netzhautregeneration, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, Chuo-ku, Kobe, 650-0047, Japan

Suguru Yamasaki, Hung-Ya Tu, Chikako Morinaga, Take Matsuyama, Junki Sho, Keizo Matsushita, Masayo Takahashi und Michiko Mandai

Forschungs- und Entwicklungszentrum für Zelltherapie, Stiftung für biomedizinische Forschung und Innovation in Kobe, Chuo-ku, Kobe, 650-0047, Japan

Masayuki Shikamura, Miyuki Nakamura und Shin Kawamata

Präklinische Forschungseinheit, Forschungsabteilung, Sumitomo Pharma Co., Ltd., Konohana-ku, Osaka, 554-0022, Japan

Hideki Adachi und Tomoaki Tochitani

Abteilung für Technologieforschung und -entwicklung, Sumitomo Pharma Co., Ltd., Chuo-ku, Kobe, 650-0047, Japan

Aya Nakamura, Kazuki Ueyama und Keiichi Ono

RIKEN-Programm für Arzneimittelforschungs- und Medizintechnologieplattformen, RIKEN Cluster for Science, Technology and Innovation Hub., Saitama, 351-0198, Japan

Chikako Morinaga & Michiko Mandai

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KW entwarf die Studie für die Off-Target-Gewebeanalyse, den Ring-PCR-Test und die RT-Konservierungsmethode, führte Experimente durch, analysierte Daten und schrieb das Manuskript. SY entwarf die Studie zur selbstorganisierenden Kultur und IHC-Analyse in vivo, führte Experimente durch, analysierte Daten und verfasste das Manuskript. HYT entwarf und führte einen elektrophysiologischen Test durch, analysierte Daten und verfasste das Manuskript. MS, T.Ka., HA, TT, YK haben eine Tumorigenitätsstudie entworfen und durchgeführt, Daten analysiert und das Manuskript verfasst. AN, KU, KO, CM, TM, JS, MN, OT, OO, MF, YH, AT, RH, HO, TH, DN, KM führten Experimente durch und analysierten Daten. AI, MT, A.Ki., T.Ki. leitete das Projekt und analysierte die Daten. SK überwachte und konzipierte eine In-vivo-Tumorigenitätsstudie, analysierte Daten und verfasste das Manuskript. MM konzipierte, überwachte und gestaltete eine In-vivo-Wirksamkeitsstudie, führte Experimente durch, analysierte Daten und verfasste das Manuskript. A.Ku. konzipierte, überwachte und entwarf selbstorganisierende Kulturen, Off-Target-Gewebeanalysen, Ring-PCR-Tests und RT-Konservierungsmethoden, führte Experimente durch, analysierte Daten, verfasste das Manuskript und genehmigte das Manuskript endgültig.

Korrespondenz mit Atsushi Kuwahara.

Diese Arbeit wurde von AMED unter der Fördernummer JP21bm0204002 (MT, SK) und von Sumitomo Pharma Co., Ltd. (Sumitomo) finanziert. KW, SY, T.Ka., HA, TT, YK, AN, KU, KO, MF, YH, AT, RH, OT, OO, HO, TH, AI, DN, KM, A.Ki. und A .Ku. sind bei Sumitomo beschäftigt. T.Ki. ist Vorstandsmitglied von Sumitomo. SK hat eine wissenschaftliche Beratungsfunktion für Sumitomo. MT und MM haben Forschungsgelder von Sumitomo erhalten. Die Autoren sind Miterfinder von Patentanmeldungen. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Communications Biology dankt Biju B. Thomas und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Simona Chera und Eve Rogers.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Watari, K., Yamasaki, S., Tu, HY. et al. Selbstorganisation, Qualitätskontrolle und präklinische Studien menschlicher iPSC-abgeleiteter Netzhautschichten für die Gewebetransplantationstherapie. Commun Biol 6, 164 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04543-5

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Eingegangen: 23. August 2022

Angenommen: 31. Januar 2023

Veröffentlicht: 10. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04543-5

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