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Sep 15, 2023

Eine Mikroperfusion und In

Wissenschaftliche Berichte Band 5,

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 18095 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Spektrometer bieten mittlerweile die für die Visualisierung von Säugetierzellen erforderlichen Feldstärken, sind jedoch nicht für die Abbildung von lebendem Gewebe ausgelegt. Daher stellen Spektrometer erhebliche Herausforderungen für die Durchführung von Experimenten in lebendem Gewebe dar – die offensichtlichste davon sind räumliche Einschränkungen. Diese Einschränkung wird problematisch, wenn versucht wird, kommerzielle Perfusionsgeräte einzusetzen, die sperrig sind und – da sie fast ausschließlich für Lichtmikroskopie- oder Elektrophysiologiestudien konzipiert sind – selten MR-Kompatibilität als Designkriterium berücksichtigen. Um Probleme zu überwinden, die ausschließlich in Umgebungen mit extrem hohen Magnetfeldern und eingeschränktem räumlichen Zugang auftreten, haben wir Mikroperfusions- und In-Bore-Oxygenierungssysteme entwickelt, die mit der Bruker-Serie von Mikrooberflächenspulen interagieren können. Diese Geräte sind für die Unterstützung der Bildgebung mit zellulärer Auflösung bei MR-Untersuchungen von exzidiertem, lebendem Gewebe konzipiert. Das kombinierte System ermöglicht eine präzise Kontrolle sowohl des gelösten Gases als auch des pH-Werts im Perfusat und demonstriert so die Anwendbarkeit für eine Vielzahl von Gewebetypen. Seine Kompaktheit, seine lineare Architektur und sein MR-kompatibler Materialgehalt sind wichtige Designmerkmale, die eine vielseitige Hardwareschnittstelle bieten sollen, die mit jedem NMR-Spektrometer kompatibel ist. Solche Eigenschaften werden den dauerhaften Nutzen des Mikroperfusionsgeräts sicherstellen, da es neben den derzeit in der Entwicklung befindlichen auch mit einer Vielzahl moderner NMR-Systeme verwendet werden kann.

Es gibt ein gut beschriebenes und etabliertes klinisches Phänomen, das eine zunehmende Wirksamkeit der Krankheitsbehandlung mit einem kürzeren Zeitintervall zwischen Krankheitsbeginn und Behandlungsanwendung korreliert1,2,3. Leider basieren die meisten modernen Diagnosen auf der Selbstauskunft des Patienten über die Krankheitssymptome, bevor Ärzte eine Diagnose und Behandlung stellen. Dies ermöglicht oft sehr lange Zeiträume der asymptomatischen Krankheitsentwicklung, bevor Patienten die notwendigen Behandlungen erhalten.

Während Biomarker-Assays äußerst empfindliche Screening-Tools zur Früherkennung von Krankheiten versprechen und so die Zeitspanne zwischen Ausbruch und Behandlung verkürzen, bieten solche Tools im Allgemeinen nur wenige Informationen über die räumlichen Eigenschaften der Gewebepathologie im lebenden Organismus. Genaue Informationen über die räumlichen Eigenschaften von erkranktem Gewebe sind bei der Patientenversorgung nicht trivial, da Kliniker in der Lage sein müssen, zwischen gesundem und ungesundem Gewebe für eine Vielzahl von Anwendungen zu unterscheiden, darunter Diagnosebestätigung, Krankheitsüberwachung nach der Behandlung und chirurgische Planung für die Tumorentfernung4 . Alternativ dazu sind diagnostische Methoden, die gewebespezifische räumliche Informationen liefern können – wie etwa die molekulare Markierung nach einer Gewebebiopsie – oft im Umfang ihrer räumlichen Daten zu begrenzt, für wiederholte Messungen oder bei der Untersuchung bestimmter Gewebe nicht geeignet und führen allzu oft zu Sekundärinfektionen, die zu Folgeschäden führen die Genesung erschweren oder verhindern5. In den letzten Jahren kam es – insbesondere bei Prostatabiopsien – zu einem Wiederaufleben von Sekundärinfektionen, was vermutlich auf einen anhaltenden Rückgang der Wirksamkeit postoperativer Antibiotika zurückzuführen ist6,7.

Es ist klar, dass klinische Bildgebungsmethoden in Verbindung mit Verbesserungen der molekularen Methoden zur Krankheitserkennung weiterentwickelt werden müssen, wenn wir das volle Potenzial beider Methoden zur Verbesserung der Patientengesundheit ausschöpfen wollen. Die Identifizierung der MR-Merkmale sowohl von gesundem als auch von erkranktem Gewebe auf zellulärer Ebene wird Aufschluss darüber geben, wie solche frühen – oft asymptomatischen – Krankheitszustände die MR-Signal- und Kontrasteigenschaften beeinflussen. Auch wenn die Mikrostruktur des Gewebes derzeit für eine direkte Beobachtung in der Klinik unzugänglich ist und dies möglicherweise auch bleiben wird, führt ein umfassendes Verständnis darüber, wie sich bestimmte Krankheitszustände auf die MR-Kontrastparameter in der Mikroumgebung auswirken, zu einem Verständnis darüber, wie pathologische Veränderungen auf mikroskopischer Ebene auftreten präsentieren sich in klinischen Scans. Solche Daten mit zellulärer Auflösung (<10 μm isotrop) müssen mit Ultrahochfeld-Bildgebungsgeräten erfasst werden, da diese die einzigen Systeme sind, die in der Lage sind, MR-Kontrastparameter im relevanten physikalischen Maßstab zu quantifizieren. Daher besteht derzeit ein Bedarf an MR-Bildgebungssystemen, die in der Lage sind, die Zellarchitektur von Säugetieren für den Einsatz in Charakterisierungsstudien von gesundem und krankem Gewebe aufzulösen.

Vorläufige MR-Bildgebungsstudien der Zellstruktur von Säugetieren wurden aufgrund der langen Sammelzeit, die für die Erstellung von Scans mit zellulärer Auflösung erforderlich ist, ausschließlich an fixierten Gewebeproben durchgeführt8,9. Obwohl diese experimentellen Bedingungen notwendig waren, um die Probenstabilität über den Verlauf langer bildgebender Experimente sicherzustellen, sind solche Bedingungen nicht ideal, da Fixiermittel bekanntermaßen die osmotischen Eigenschaften, die Membranpermeabilität und die Relaxationseigenschaften des Gewebes verändern10,11,12,13.

MR-Mikroskopiestudien, die an lebenden Gewebeexplantaten durchgeführt wurden, litten traditionell unter einer geringen, dh nicht zellulären, Auflösung sowie einer ungenauen Kontrolle der Perfusatbedingungen an der Stelle des isolierten Gewebes. Die Unfähigkeit, die Zellstruktur direkt sichtbar zu machen, wurde inzwischen durch enorme Verbesserungen in der Hochfrequenz-Mikrospulentechnologie (RF) überwunden14,15,16,17,18,19,20,21,22. Die Fähigkeit, die Perfusatbedingungen während MR-Mikrobildgebungsexperimenten wirksam zu kontrollieren, wurde jedoch nicht ausreichend berücksichtigt. Für Explantatstudien stehen zahlreiche Iterationen von Perfusionsgeräten zur Verfügung, die eine hervorragende Kontrolle der Probenbedingungen sowie innovative Funktionen wie Mikronadel-Arrays zur Verbesserung der Metabolitenabgabe bieten23,24,25,26. Ein wesentlicher Nachteil der meisten modernen Perfusionssysteme ist jedoch die mangelnde MR-Kompatibilität während der Konzept- und Designphase ihrer Entwicklung. Daher ist es äußerst unpraktisch, solche Geräte so zu modifizieren, dass sie mit vorhandenen MR-Bildgebungssystemen verbunden werden können, da sowohl räumliche als auch materielle Einschränkungen bei der Arbeit mit Ultrahochmagnetfeld-Scannern bestehen.

Um den Bedarf an zuverlässiger, MR-kompatibler Mikroperfusionshardware für die Verwendung mit lebenden Explantaten zu decken, haben wir ein Geweberetentions-/Perfusionssystem speziell für den Einsatz in zellulären Auflösungsstudien entwickelt und hergestellt. Das Prototypsystem ist mit einer modifizierten, kommerziell erhältlichen Mikrooberflächenspule (Bruker Biospin, B6370) verbunden. Neben detaillierten Schaltplänen und Herstellungsverfahren berichten wir über die Ergebnisse von Tests zur Quantifizierung des gelösten Sauerstoffgehalts und des pH-Werts unserer künstlichen Liquor cerebrospinalis (aCSF) sowie der MR-Signalstabilität im Zeitverlauf in Experimenten, bei denen unser In-Bore-Oxygenator verwendet wird. Im Fall der Quantifizierung gelöster Gase und des pH-Werts werden die Ergebnisse von Tests mit dem In-Bore-Oxygenator mit äquivalenten Experimenten verglichen, bei denen ein externes Membran-Oxygenatorgerät früherer Bauart verwendet wurde27.

Eine Mikrooberflächenspule mit 500 μm Durchmesser (Bruker Biospin, Z76409) wurde so modifiziert, dass sie mit dem Mikroperfusionsgerät verbunden ist. Auf der Rückseite der Kunststoffbaugruppe der Spule wurde ein Kanal (15 mm LN × 3 mm HT × 4 mm D) angebracht. Zwei Nylon-Abstandshalter (6 mm LN × 4 mm HT 0,5 mm W) wurden flankierend zum Kanal geklebt und bis zur halbkreisförmigen Kontur der Spule gefeilt. Zwei schmalere, beidseitige Rillen (3 mm HT × 1,5 mm D) wurden vom Kanal verlängert, bis sie sich um die Spulenbaugruppe wickelten. Ein Loch (2 mm Durchmesser × 14 mm D) wurde in die Oberseite der Spulenbaugruppe gebohrt, zentriert entlang ihrer Breite und direkt hinter der Chipplatte.

Zwischen dem begasten Perfusatreservoir und den Oxygenatoren wurden Perfusionsleitungen mit hoher Gasretention (Cole-Parmer, 06508-13) eingesetzt. Im externen Oxygenator-Aufbau überbrückte diese Leitung auch den Oxygenator und den Perfusionsbrunnen. Eine peristaltische Pumpe (Masterflex L/S, 7519-20) trieb die Perfusion an (2 ml/min). Für die Perfusionskammer (150 μm Volumen) wurde der Acetalstab in eine einzelne Konfiguration mit offenem Ende (9,5 mm Außendurchmesser, 6 mm LN, 6 mm Innendurchmesser) bearbeitet. Das offene Ende war um 30° abgeschrägt, um eine Silikondichtung (Amazon, ORS-009-25) aufzunehmen, die mit Silikondichtmittel befestigt wurde. In das geschlossene Ende des Perfusionsschachts wurde ein horizontaler Kanal (2,5 mm HT × 1 mm D) gefräst, um einen Kabelbinder aufzunehmen (Thomas & Betts, SF100-18). Zufluss- und Abflussleitungen (Cole-Parmer, S-06418-02) wurden mit Urethan an Ort und Stelle gehalten und im Inneren des Bohrlochs versetzt (3 mm), um den turbulenten Fluss zu maximieren und Metabolitengradienten zu minimieren. Nylon-Haltering (5 mm Außendurchmesser, 4 mm Innendurchmesser, 300 μm dick) und Netz (4 mm Durchmesser, 2 mm × 1,5 mm Fenster, 50 μm Porengröße) wurden von Hand aus einer Nylonscheibe (Amazon, B00DHVBPOO) geformt gewebte Nylonfolie (Amazon, CMN-0053-C).

Ein NMR-Röhrchen mit 5 mm Durchmesser (Wilmad, WG-1000-7) wurde in ein 16,5 cm langes Glasrohr umgewandelt, das als Gaseinlasskammer (Innenkammer) diente. In die Oberseite der 5-mm-Rohrkappe wurde ein Loch (1,5 mm Durchmesser) geschnitten, um die Carbogen-Versorgungsleitung aufzunehmen. Als nächstes wurde ein 10-mm-NMR-Probenröhrchen (Wilmad, 513-1 PP-7FB) in ein 18 cm langes Glasrohr umgewandelt, um die Gasaustauschkammer (Außenkammer) zu bilden. In die Mitte der Kappe des 10-mm-Röhrchens wurde ein Loch (6 mm Durchmesser) geschnitten, um die 5-mm-Röhrchenbaugruppe aufzunehmen. Oben im Deckel des 10-mm-Röhrchens wurden zwei zusätzliche Löcher (Durchmesser 1 mm) angebracht. Einer diente als Austauschmembraneinlass, während der andere offen blieb, um einströmendes Carbogen abzulassen. Ein Silikon-Austauschschlauch (HelixMark, 60-011-03) wurde durch die obere 10-mm-Röhrchenkappe eingeführt, eng um das eingebettete 5-mm-Röhrchen im Gasaustauschfach gewickelt und durch eine zweite 10-mm-NMR-Röhrchenkappe am Oxygenator geführt Base. Diese Kappe enthielt in der Mitte einen Acetalstift (20 mm HT, 2 mm Durchmesser), der durch Urethan an Ort und Stelle gehalten wurde. Die nach außen geführten Längen der Gasaustauschschläuche wurden auf zwei 10,0-mm-Segmente minimiert, die über eine 1/16-Zoll-Nylonkupplung (Eldon James Corp., C0-1 NN) mit Perfusionsleitungen (Cole-Parmer, S-06418-02) verbunden waren, die etwas höhere Leistungen erbrachten Gasretention. Die Perfusionsleitung, die am Boden des Oxygenators austritt, war direkt mit der Zuflussleitung der Perfusionskammer verbunden. Die untere 10-mm-NMR-Röhrchenkappe wurde ohne Urethan befestigt, um Zugang zum Inneren des Oxygenators für den Membranaustausch zu erhalten.

Messungen des prozentualen gelösten Sauerstoffs von aCSF-Perfusat (120 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 1,5 mM KH2PO4, 1,4 mM MgSO4·7 H2O, 2 mM CaCl2·2 H2O, 3 mM KCl, 10 mM Glucose; Osmolalität = 300 mOsm) wurden gesammelt unter Verwendung eines Sauerstoffmessgeräts (Microelectrodes Inc., OM-4), das an eine volumenbegrenzte Mikroelektrodensonde (Microelectrodes Inc., MI-730) angeschlossen ist. Es wurden mehrere Versuche (n = 6) durchgeführt, bei denen Messungen des gelösten Sauerstoffs aus dem Perfusatreservoir durchgeführt wurden, das direkt mit 95 % O2, 5 % CO2-Carbogen (Positivkontrolle) durchperlt wurde, oder aus der Perfusionskammer bei Versuchen, bei denen die Innenbohrung verwendet wurde Der Oxygenator wurde mit Gasen unterschiedlichen Sauerstoffgehalts versorgt (Umgebungsluft, 95 %, 60 % und 19 %). Um die Funktion des In-Bore-Oxygenators mit der des externen Membran-Oxygenators zu vergleichen, wurden zusätzliche Messungen (n = 10) in der Perfusionskammer durchgeführt, während das externe Oxygenatorgerät während der Anlage mit Carbogengas (95 % O2, 5 % CO2) versorgt wurde Betrieb (2 ml/min).

Die pH-Werte von aCSF-Perfusat wurden mit einem Accumet Basic pH-Meter (Fisher Scientific, AB15) bewertet, das an eine Probensonde mit geringem Volumen (Mettler Toledo, 6030-02-BNC) angeschlossen war. Die Messungen wurden im Perfusatbrunnen (n = 8) durchgeführt, wobei das betriebsbereite Perfusionsgerät (2 ml/min) entweder mit dem externen oder im Bohrloch befindlichen Membranoxygenator verbunden war. Das aCSF-Reservoir wurde direkt mit Carbogengas (95 % O2, 5 % CO2) durchperlt, während die gleiche Gasmischung sowohl externen als auch internen Oxygenatoren zugeführt wurde. Die Ergebnisse aus den acht Versuchen wurden gemittelt und die Mittelwerte beider Behandlungsgruppen mit dem angestrebten physiologischen pH-Bereich (7,3–7,4) verglichen.

Die gesamte Bildgebung wurde auf einem 600-MHz-Spektrometer (Oxford) durchgeführt, das mit Mikrobildgradienten (Bruker Biospin; Micro 5) ausgestattet war. Die Probentemperatur (23 °C ± <1 °C) wurde kontinuierlich gemessen und mithilfe einer Rückkopplungsschleife vom Thermoelement zu einer Kühleinheit (Bruker, BCU II −80/60) konstant gehalten, die die durch die Spektrometerbohrung strömende Lufttemperatur regelt. Alle Daten wurden mithilfe einer diffusionsgewichteten Spin-Echo-Sequenz gesammelt. Die Diffusionsgewichtung wurde konstant bei b = 1200 s/mm2 gehalten: ein Kompromiss, der in der verfügbaren Scanzeit eine ausreichende Empfindlichkeit gegenüber Gewebeveränderungen sowie ein angemessenes Signal-Rausch-Verhältnis (400–500 typisches SNR) bietet. Die Datenanalyse wurde offline mit einer statistischen Toolbox (Microsoft Excel) und Matlab® durchgeführt. Vierzehn aufeinanderfolgende diffusionsgewichtete Spin-Echo-Scans (TR/TE = 2000/11,64 ms, b = 1200 s/mm2, Res = 31,25 μm isotrop, Dauer = 1,5 h, Durchschnitt = 42) wurden gesammelt (n = 3) und das Signal vergleichen Stabilität über die Zeit (insgesamt 21 Stunden). Um homogene Feldbedingungen zu gewährleisten, wurde manuelles Shimming eingesetzt28. Die Shim-Einstellungen wurden mithilfe von Messungen der Linienbreite auf halber Höhe des Wassersignalpeaks – typischerweise ≤ 35 Hz – bewertet, die sowohl bei Anwesenheit als auch bei Abwesenheit des In-Bore-Oxygenators beobachtet wurden: Das heißt, die Verwendung des Geräts führte zu keinen erkennbaren Feldinhomogenitäten. Identische Bildgebungsprotokolle wurden in jeder der beiden Versuchsgruppen eingesetzt: eine Serie mit kontinuierlicher Perfusion (2 ml/min) und eine Serie ohne Perfusion (stabile Kontrolle). Die rohen Diffusionssignalwerte – erhalten als durchschnittliche Signalintensität über einen interessierenden Bereich – aus den drei Bildern, die zu jedem der vierzehn Zeitpunkte aufgenommen wurden, wurden gemittelt und als Funktion der Zeit aufgetragen, um die Signalvariabilität innerhalb der Gruppe über das 21-Stunden-Experiment zu bewerten. Statistische Vergleiche zwischen Behandlungsgruppen wurden mithilfe von Äquivalenztests durchgeführt. Der Äquivalenzbereich (+/–9 % Mittelwert) wurde auf der Grundlage der gesamten gruppeninternen Signaländerung bestimmt, die in der nicht perfundierten – d. h. stabilen statischen Kontrollgruppe – im Zeitverlauf der Studie beobachtet wurde. Beide Bilddatensätze für unsere Stabilitätstests wurden an einem fixierten Mauskortex (300 μm dick) durchgeführt, um morphologische Probenveränderungen als mögliche Ursache für beobachtete Diffusionssignaländerungen auszuschließen.

Akute kortikale Schnitte (n = 4, 300 μm dick) von Ratten wurden mittels Vibratom in einem kontinuierlich begasten (95 % O2, 5 % CO2) aCSF-Bad bei 4 °C isoliert, bevor sie in die Mikroperfusionsanlage eingeführt wurden. Die Proben wurden vor der Bildgebung für einen Zeitraum von 1 Stunde unter kontinuierlicher Perfusion an 23 °C akklimatisiert. Diffusionsgewichtete Bilder (TR/TE = 2000/11,6 ms, b = 1200 s/mm2, Res = 31,25 μm isotrop) wurden in langen und kurzen Bildgebungsintervallen (Dauer = 1,5 Stunden, Durchschn. = 42; Dauer = 4 Min., Durchschn.) aufgenommen = 2) mit Variationen in den Perfusionsbedingungen (kontinuierlich = 1,5-stündige Scans mit eingeschalteter Perfusion über den gesamten 21,5-stündigen Zeitraum; intermittierend = 1,5-stündige Scans mit ausgeschalteter Perfusion während der Datenerfassung, aber eingeschaltet für 10-minütige Perfusionsintervalle dazwischen; langes Intervall/langer Scan = 1,5-stündige Scans mit eingeschalteter Perfusion während der Datenerfassung und ausgeschaltet während der 10-minütigen Intervalle zwischen den Scans; lange Intervalle/kurze Scans = 4-minütige Scans mit ausgeschalteter Perfusion, dazwischen 1,5-stündige Intervalle mit eingeschalteter Perfusion. Daten zum nicht durchbluteten Kortex wurden mit einem lebenden, akuten Schnitt erzeugt, der im Rig platziert und abgebildet wurde (TR/TE = 2000/11,6 ms, b = 1200 s/mm2, Res = 31,25 μm isotrop, Dauer = 1,5 h, Durchschn. = 42). ein 15,5-stündiger Zeitverlauf ohne aCSF-Perfusataustausch. In ähnlicher Weise wurden stabile Kontrolldaten mithilfe eines festen Schnitts über einen Zeitraum von 18,5 Stunden mit identischen Bildgebungsparametern und ohne Perfusion generiert. Die Intensität des Diffusionssignals (willkürliche Einheiten) wurde je nach Versuchsgruppe über einen Zeitraum von 15,5 bis 21,5 Stunden aufgezeichnet.

Detaillierte Schemata der Mikro-Oberflächenspulenmodifikation, der Mikroperfusions-Rig-Baugruppe und der In-Bore-Oxygenator-Vorrichtung werden bereitgestellt (Abb. 1 und 2). Ein Blockdiagramm der Bohrinselanordnung mit sowohl externen als auch in der Bohrung befindlichen Oxygenator-Aufsätzen ist ebenfalls dargestellt (Abb. 3).

Explosionszeichnung mit detaillierten Angaben zu den einzelnen Komponenten der Mikroperfusionsanlage.

(a) Perfusat gut bearbeitet aus Acetalstab (150 μl Volumen, 9,5 mm Außendurchmesser, 6 mm LN, 6 mm Innendurchmesser). Die offene Seite (······) ist 30° von der Vertikalen abgeschrägt, um den Sitz einer Silikondichtung zu ermöglichen. Die geschlossene Seite enthält einen horizontalen Kanal (2,5 mm HT × 1 mm D), in dem ein flacher Kabelbinder (Thomas & Betts, SF100-18) (nicht abgebildet) sitzt, der als nicht permanentes Mittel zur Abdichtung der Perfusionskammer dient. Zufluss- und Abflussleitungen (Cole-Parmer, S-06418-02) treten durch die Oberseite des Perfusionsschachts ein und werden mit von außen aufgetragenem Urethan mit hoher Abziehfestigkeit an Ort und Stelle befestigt. (b) Silikon-O-Ring (Amazon, ORS-009-25), der als flüssigkeitsdichte Dichtung zwischen Perfusionsbrunnen und Gewebebrunnen dient. Es wird mit einem für Aquarien geeigneten Silikondichtmittel am Perfusionsbrunnen befestigt. (c) Nylon-Haltering (5 mm Außendurchmesser, 4 mm Innendurchmesser, 0,5 mm Wandstärke, 300 μm Dicke), handgefertigt aus einer flachen Nylonscheibe (Amazon, B00DHVBPOO). Mit einem Blechstanzer wurde der Innendurchmesser auf 3,97 mm erweitert. Die Dicke wurde mit einer Metallfeile reduziert. Zuletzt wurde mit einem Skalpell eine Kerbe (2 mm) in den Ring geschnitten, um vor dem Einführen in die Gewebevertiefung eine Kompression zu ermöglichen. (d) Für die Konstruktion des Retentionsnetzes wurde gewebtes Nylon (Amazon, CMN-0053-C) mit einer Porengröße von 50 μm verwendet. Aus dem Blech wurde eine kreisförmige Scheibe (Durchmesser 4 mm) ausgeschnitten und aus dem Mittelteil, das die Spulenfläche überlappte, ein Fenster (2 mm × 1,5 mm) ausgeschnitten. Dieses Fenster unterstützte die Gewebeplatzierung, indem es eine klare Sicht auf den Probenbereich in Kontakt mit der Spule ermöglichte und verhinderte, dass Nylon in das Anregungsprofil der Spule eindrang. (e) Gewebeschnitte (Hippocampus im Bild) mit einer Dicke von 300 μm werden in direktem Kontakt mit der Oberflächenspule platziert und mithilfe des Netzeinsatzes und des Halterings vertikal aufgehängt. (f) Die Mikro-Oberflächenspule mit vier Windungen (Durchmesser 500 μm) ist unten auf der 5-mm-Durchmesser-Spule abgebildet. Gewebe gut. Zusätzliche Komponenten der Spulenbaugruppe (Leitungen, Kondensatoren, Kunststoffsockel usw.) sind nicht dargestellt.

Fotos der modifizierten 500-μm-Mikrospule und detailliertes Schema des In-Bore-Oxygenators.

(a) Rückansicht der Mikrospulenbaugruppe mit Darstellung eines gefrästen Kanals (15 mm LN × 3 mm HT × 4 mm D), flankiert von Nylon-Abstandshaltern (, 6 mm LN × 4 mm HT × 0,5 mm W), die ein niedriges Profilkabelbinder (Thomas & Betts, SF100-18). (b) Vorderansicht der Mikrospule mit detaillierten bilateralen Rillen (3 mm HT × 1,5 mm D). Ausschnitte boten Platz für den Kabelbinder, der zur reversiblen Abdichtung des Perfusionsbrunnens verwendet wurde. (c) Draufsicht auf die Spulenbaugruppe. Ein Loch (2 mm Durchmesser × 14 mm D) nimmt den Acetal-Stützstift des In-Bore-Oxygenators auf. (d) Detaillierte schematische Darstellung des In-Bore-Oxygenator-Geräts (verschachtelte, offene 5-mm- und 10-mm-NMR-Röhrchen; 19 cm hoch x 1 cm breit). Nach dem Durchlaufen einer Inline-Blasenfalle gelangt das CSF-Perfusat über einen hochgasdurchlässigen Silikonschlauch (HelixMark, 60-011-03) in den In-Bore-Oxygenator. Dieser Schlauch (), der die Gasaustauschmembran des Oxygenatorgeräts darstellt, wurde eng in die ineinander gesteckten NMR-Röhrchen gewickelt, um die Oberfläche zu maximieren, über die der Gasaustausch stattfindet. Carbogen-Gas tritt durch eine Öffnung oben im Deckel des 5-mm-Röhrchens ein und gelangt durch den offenen Boden des 5-mm-Röhrchens in die Gasaustauschkammer (10-mm-NMR-Röhrchen) (). Durch die Platzierung einer Entlüftung oben am 10-mm-Rohr wird sichergestellt, dass das Carbogen über die gewickelte Membran strömt, wenn das Gas aus der Oxygenatorbaugruppe austritt. Mit Carbogen gesättigter aCSF tritt durch die Bodenkappe des 10-mm-Röhrchens aus und gelangt in die Perfusionskammer. Der drastisch verringerte Abstand zwischen der Stelle des Gasaustauschs und der Stelle der Gewebeperfusion (2 cm in der Bohrung gegenüber 500 cm außen) ist für die deutlich verbesserten Gasrückhalteeigenschaften verantwortlich. Künstlicher CSF verlässt die Anlage über eine Rücklaufleitung auf dem Weg zu einem Abfallreservoir außerhalb des Spektrometers. Die Enden der Silikonmembran () wurden mit Nylonkupplungen () (Eldon James, C0-1AGHDPE) an Tygon®-Leinen () (Cole-Parmer, S-06418-02) gespleißt.

Blockdiagramme der Mikroperfusionsanlage in Dual-Oxygenator-Konfigurationen.

(a) Aufbau eines externen Oxygenators. Übermäßig lange Mikroperfusionsleitungen (5 m) (Cole-Parmer, 06508-13) zwischen dem externen Oxygenator (45 cm breit × 60 cm hoch × 30 cm tief) und der Perfusionskammer führen zu einer erheblichen Entgasung unseres aCSF-Perfusats, bevor es auf das Gewebe trifft Scheibe. Diese Entgasung war für den niedrigen Sauerstoffgehalt (O2-Verlust) und den hohen pH-Wert (CO2-Verlust) verantwortlich, der in der Perfusionskammer mit dem externen Oxygenatoraufbau aufgezeichnet wurde, und trat trotz der Verwendung von Perfusionsleitungen auf, die für eine hohe Gasretention ausgelegt sind. (b) In-Bore-Oxygenator-Aufbau. Die Teile des Membranoxygenators (19 cm hoch × 1 cm Durchmesser) und der Blasenfalle (9 cm hoch × 1 cm Durchmesser) des Mikroperfusionsgeräts wurden ausschließlich unter Verwendung von MR-kompatiblen Materialien neu gestaltet. Darüber hinaus wurden die Abmessungen dieser Komponenten so reduziert, dass sie nun direkt in den schmalen Kanal der Spektrometerbohrung (3,5 cm Durchmesser) passen. Während immer noch eine erhebliche Entgasung zwischen dem mit Carbogen-Blasen versehenen aCSF-Reservoir und dem bildgebenden Spektrometer auftritt, reduziert das In-Bore-Oxygenatorgerät die Länge der Perfusionsleitung zwischen dem Endpunkt des Gasaustauschs und der Gewebeprobe (2,5 cm) drastisch und bewahrt so physiologisch relevanten gelösten Sauerstoff und pH-Werte.

Dargestellt ist der im aCSF am Gewebeschacht (n = 6) gemessene Gehalt an gelöstem Sauerstoff als Funktion der Gase mit variablem Sauerstoffgehalt, die vom In-Bore-Oxygenatorgerät zugeführt werden (Abb. 4). Atmosphärisches Gas (20–22 % O2) und drei Gemische aus Carbogen (5 % CO2) mit unterschiedlichen Sauerstoffkonzentrationen (95 %, 60 %, 19 % O2), Rest Stickstoff, wurden im In-Bore-Oxygenator getestet. Die durchschnittlichen Messwerte für gelösten Sauerstoff für die Ergebnisse von sechs Versuchen betrugen 23,0 %, 96,2 %, 59,1 % und 19,2 % für Umgebungsluft (20–22 %), 95 %, 60 % bzw. 19 % O2-Gase. Die Ergebnisse werden mit Positivkontrollversuchen (n = 6) verglichen, die im Perfusatreservoir während der direkten Einleitung von 95 % O2, 5 % CO2-Carbogengas durchgeführt wurden: 95,1 % O2 gemessen. Wiederholte Messungen zeigen einen Gassättigungseffekt von 100 % (dh die prozentuale Sättigung im Gewebe stimmt gut mit dem prozentualen O2-Gehalt des zugeführten Gases überein), wenn der In-Bore-Oxygenator verwendet wird. Umgekehrt entsprach bei Verwendung des externen Oxygenators der Gehalt an gelöstem Gas an der Stelle der Gewebeperfusion nicht dem prozentualen Sauerstoffgehalt des Versorgungsgases (Tabelle 1). In wiederholten Tests (n = 10) betrug der durchschnittliche Gehalt an gelöstem Sauerstoff im aCSF an der Gewebeperfusionsstelle 43,43 % O2, wenn ein Versorgungsgas mit einer O2-Konzentration von 95 % verwendet wurde. Dies stellt einen Verlust von insgesamt 54,3 % gelöstem O2 dar, der zwischen dem Perfusatreservoir (95,54 % O2-Positivkontrolle) und der Perfusionskammer (43,43 % O2) auftritt, gemessen mit dem externen Membranoxygenator.

Eigenschaften des gelösten Sauerstoffgases (O2) von aCSF an der Stelle der Gewebeperfusion unter Verwendung des In-Bore-Oxygenators mit Gasen mit variablem Sauerstoffgehalt.

Drei Gemische aus Carbogengas (5 % CO2 + 95 %, 60 %, 19 % O2, Rest N2) werden mit einem aCSF-Reservoir verglichen, das atmosphärischem Gas (20–22 % O2; 23 % gemessen) und einer Positivkontrolle (direkt eingeperltes 95 %) ausgesetzt ist % O2, 5 % CO2 Carbogen). In allen drei Fällen nähert sich der gemessene Gehalt an gelöstem Sauerstoff im aCSF einer 100-prozentigen Sättigung der im zugeführten Gasgemisch enthaltenen Konzentration. Die Daten werden als Gruppendurchschnitte (n = 6) mit positiven Fehlerbalken dargestellt, die der berechneten Standardabweichung entsprechen.

Die Ergebnisse mehrerer Versuche (n = 8, Versorgungsgas = 95 % O2, 5 % CO2) zur Messung des pH-Werts an der Stelle der Gewebeperfusion werden vorgestellt (Tabelle 1). Der durchschnittliche pH-Wert im aCSF unter Verwendung des In-Bore-Oxygenators (7.32) wurde mit dem Wert verglichen, der mit dem externen Oxygenator (8.13) ermittelt wurde. Nur die Messwerte, die beim Einsatz des In-Bore-Oxygenators ermittelt wurden, lagen innerhalb eines Ziel-pH-Bereichs, der aufgrund seiner Fähigkeit zur Aufrechterhaltung des physiologisch relevanten Nervengewebestoffwechsels ausgewählt wurde (7,3–7,4). Die Ergebnisse der pH-Messungen aus einem direkt mit Luftblasen versehenen aCSF-Reservoir (Positivkontrolle, 7,36) lagen im physiologischen Bereich, während die Ergebnisse aus einem unbehandelten (d. h. entgasten) aCSF-Reservoir (Negativkontrolle, 8,22) eher den Messwerten ähnelten, die bei Verwendung des externen Oxygenators erzielt wurden .

Das diffusionsgewichtete MR-Signal (willkürliche Einheiten) als Funktion der Versuchszeit (insgesamt 21 Stunden) wird für zwei Versuchsbedingungen angegeben: Versuche mit kontinuierlicher Perfusion (2 ml/min) und statische Versuche ohne Perfusion (Kontrolle) (Abb. 5). ). Das durchschnittliche Signal aus mehreren Experimenten (n = 3) wird berechnet und zu 12 verschiedenen 1,5-Stunden-Zeitpunkten grafisch dargestellt. Statistische Äquivalenztests ergaben, dass die Äquivalenzkriterien zu allen getesteten Zeitpunkten erfüllt waren. Die zu den Zeitpunkten 4,5 und 6,0 ​​Stunden (n = 2) präsentierten Daten enthielten eine Messung weniger als die übrigen Gruppen aufgrund einer Hardwarestörung, die während der Erfassung der dritten Serie auftrat (Abb. S1 und S2) und wurden daher von der statistischen Prüfung ausgeschlossen .

Testen der MR-Signalstabilität in fixierten kortikalen Mausschnitten (300 μm) unter Bedingungen konstanter Perfusion und keiner Perfusion.

Diffusionsgewichtetes Signal (willkürliche Einheiten) über die Zeit (insgesamt 21 Stunden) in Bildgebungsserien mit kontinuierlicher (: 2 ml/min) und statischer (: kein Perfusatfluss) Kontrolle. Es wird das durchschnittliche Signal (n = 3) über 12 separate Bildgebungsexperimente angegeben. Eine von drei Messungen zu den Zeitpunkten 4,5 und 6,5 Stunden wurde aufgrund einer Hardwarestörung, die die Erfassung beeinträchtigte, aus der dritten Serie ausgeschlossen. Statistische Tests zeigen, dass die Bedingungen für die Äquivalenz zwischen den Gruppen (Bereich = Signalvarianz über die Zeit [21 Stunden] unserer statischen Kontrollgruppe [±9 %]) zu allen 12 getesteten Zeitpunkten erfüllt waren. Die Daten werden als Gruppendurchschnitte mit positiven und negativen Fehlerbalken dargestellt, die der Standardabweichung entsprechen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wurden in der statischen Kontrollgruppe Fehlerbalken weggelassen.

Die durch die diffusionsgewichtete MR-Signalintensität angezeigte Gewebestabilität wurde für alle Live-Schnittdatensätze als Funktion der Experimentzeit (15,5 bis 21,5 Stunden) analysiert (Abb. 6). Das zu jedem Zeitpunkt gemeldete Signal ist die mittlere Signalintensität über einen großen interessierenden Bereich (ROI). Für jede Probe wurde für alle Zeitpunkte derselbe ROI verwendet. Um einen Vergleich der Signalstabilität zwischen den Perfusionsstrategien zu ermöglichen, normalisieren wir jede Datenreihe auf die Intensität bei ihrer ersten Messung (3 Stunden). In dieser Datendarstellung würde unzureichend durchblutetes Gewebe im Laufe der Zeit aufgrund der durch Ischämie verursachten verringerten Diffusivität eine erhöhte Signalintensität aufweisen. Wir beziehen auch die Signalkurve von fixiertem Gewebe (ebenfalls normalisiert auf seine Intensität zum Anfangszeitpunkt) als Referenzzeitreihe einer vollständig stabilen Probe ein. Experimente mit vier unabhängigen Perfusionsprotokollen werden mit fixiertem Gewebe (stabile Kontrolle) und nicht perfundiertem lebendem Gewebe (unzureichende Metabolitenkontrolle) verglichen. Wie erwartet zeigt der nicht perfundierte Kortex (Abb. 6a) einen abrupten und anhaltenden Anstieg des Diffusionssignalverhaltens. Umgekehrt bleiben die von der festen Probe erhaltenen Diffusionsmessungen über den gesamten 18,5-stündigen Zeitraum relativ konstant (). Perfundierte, lebende Kortikalisschnitte (Abb. 6a) weisen unterschiedliche Grade der Diffusionssignaländerung auf, wobei die deutlichste in der kontinuierlich perfundierten Kortikalisprobe () nach dem 14-Stunden-Zeitpunkt zu sehen ist. In Abb. 6a sind die verbleibenden Perfusionsregime: intermittierende Perfusion (), lange Perfusionsintervalle gefolgt von kurzen Scans () und lange Perfusionsintervalle gefolgt von langen Scans (). Informationen zu Intervalllängen finden Sie im Methodenabschnitt zur Live-Slice-Perfusion.

Charakterisierung lebender, akuter Kortikalisschnitte von Ratten mithilfe der Mikroperfusion und des In-Bore-Oxygenator-Geräts.

Es wird ein diffusionsgewichtetes MR-Signal (willkürliche Einheiten) angegeben, normiert auf die anfängliche Messung (3 Stunden) als Funktion der Experimentzeit (15,5 bis 21,5 Stunden). (a) Experimente unter Verwendung von vier unabhängigen Perfusionsprotokollen werden mit fixiertem Gewebe (stabile Kontrolle) und nicht perfundiertem lebendem Gewebe (metabolische Insuffizienz) verglichen. Nicht perfundierter Kortex zeigt einen abrupten und anhaltenden Anstieg des Diffusionssignals (3 bis 15,5 Stunden), während die fixierte Probe durchgehend relativ konstant bleibt (3 bis 18,5 Stunden). Akute kortikale Schnitte, die einer Perfusion unterzogen werden, weisen im Laufe der Zeit geringfügige Signaländerungen auf, die zwischen denen liegen, die unter den beiden Kontrollbedingungen beobachtet wurden. Schlüssel für perfundierte Versuche (kontinuierlich = 1,5-stündige Scans mit eingeschalteter Perfusion für den gesamten Zeitraum von 21,5 Stunden; intermittierend = 1,5-stündige Scans mit ausgeschalteter Perfusion während der Datenerfassung, aber eingeschaltet für 10-minütige Perfusionsintervalle dazwischen; langes Intervall/langer Scan = 1,5-stündige Scans mit Perfusion eingeschaltet während der Datenerfassung und ausgeschaltet während der 10-Minuten-Intervalle zwischen den Scans; lange Intervalle/kurze Scans = 4-minütige Scans mit ausgeschalteter Perfusion, dazwischen 1,5-stündige Intervalle mit eingeschalteter Perfusion). (b) Bei der Gruppierung der Daten aus perfundierten Versuchen über ihren gemeinsamen Zeitverlauf (3 bis 15,5 Stunden) zeigen diese Schnitte ein Diffusionssignalstabilitätsverhalten, das den Kontrollen mit festem Gewebe ähnelt. Das diffusionsgewichtete MR-Signal (willkürliche Einheiten), normiert auf die anfängliche Messung (3 Stunden), wird als Funktion der Zeit angegeben. Die Daten werden als Gruppenmittelwerte (n = 4) angegeben, wobei positive und negative Fehlerbalken dem Standardfehler des Mittelwerts entsprechen.

Abbildung 6b zeigt alle diese Perfusionsstrategien gruppiert und mit dem Signalzeitverlauf einer nicht perfundierten akuten Schicht und einer fixierten Probe verglichen. Dieses Diagramm ist auf den Zeitverlauf einschließlich aller gemessenen Bedingungen (3,0 h bis 15,5 h; Abb. 5b) beschränkt. Die perfundierten kortikalen Schnitte weisen stabile Diffusionssignaleigenschaften auf, die denen von Festgewebekontrollen ähneln.

In der vorliegenden Studie beschreiben wir ein neu entwickeltes und hergestelltes Mikroperfusionssystem und Oxygenatorgerät zur Verwendung in Explantatstudien, die in Umgebungen mit extrem hohen Magnetfeldern durchgeführt werden. Diese Komponenten wurden speziell entwickelt, um den starken räumlichen und materiellen Einschränkungen zu entsprechen, die durch Hochfeld-MR-Bildgebungsgeräte in Zellstudien entstehen, und verfügen daher über besondere Eigenschaften, die in keinem bestehenden kommerziellen Mikroperfusionsgerät verfügbar sind. Wichtig ist, dass alle Rig-Materialien mit der elektromagnetischen Umgebung (statische und zeitlich veränderliche Felder) des MR-Experiments kompatibel sind, sodass sie sowohl sicher zu handhaben sind als auch die Messqualität nicht beeinträchtigen (z. B. durch Verschlechterung der Hauptfeldhomogenität). Darüber hinaus wies unser In-Bore-Oxygenatorgerät eine Sättigungscharakteristik von 100 % gelöstem Sauerstoff (O2) auf, die unter Verwendung mehrerer Sauerstoffkonzentrationen in vorgemischtem Carbogen-Versorgungsgas getestet wurde (Abb. 4). Diese Ergebnisse deuten auf einen O2-Verlust von praktisch 0 % in der Sauerstoffgassättigung unseres aCSF hin, wenn der In-Bore-Oxygenator und die Mikroperfusionsanlage verwendet werden. Darüber hinaus zeigen sie, dass die O2-Sättigung an der Stelle der Gewebeperfusion durch Regulierung ihrer Konzentration im Versorgungsgasgemisch präzise gesteuert werden kann. Diese Funktion erhöht die Kontrolle des Bedieners, indem sie es Forschern ermöglicht, experimentelle Bedingungen auf der Grundlage gewebespezifischer – und sogar aktivitätsabhängiger – Unterschiede im Stoffwechselbedarf anzupassen29,30,31,32. Eine solche Präzision und Kontrolle am Ort der Gewebeperfusion – in diesem Fall innerhalb der Bohrung eines bildgebenden Spektrometers – sind für die Erstellung gut konstruierter, reproduzierbarer wissenschaftlicher Studien mit Ex-vivo-Probenvorbereitungen unerlässlich. Unsere Feststellung, dass mehr als die Hälfte (54,3 %) des gelösten O2-Gehalts unseres aCSF während der Reise von einem externen Membranoxygenator zur Gewebevertiefung (5 m) verloren ging, unterstreicht die Notwendigkeit zusätzlicher MR-spezifischer Hardwareentwicklung. Dass solche Ergebnisse auch bei Verwendung von Perfusionsleitungen mit hoher Retention und geringer Gasdurchlässigkeit erzielt wurden (Cole-Parmer, 06508-13), legt nahe, dass einfache technische Lösungen, die an bereits vorhandenen Perfusionsgeräten nachgerüstet werden, nicht ausreichen, um geeignete experimentelle Bedingungen in der Ex-vivo-MR-Mikroskopie zu erreichen Studien.

Obwohl die aktuelle Studie keine direkte Quantifizierung des gelösten CO2-Gases beinhaltete, wie sie mit Sauerstoff durchgeführt wurde, dienten die pH-Werte in unserem mit Bicarbonat gepufferten aCSF als empfindliches Maß für die Wirkung des Gases. Dies ist auf die Rolle zurückzuführen, die zugeführtes CO2 bei der Bildung von Carbonat- und Bicarbonat-Ionen – und damit freien Protonen – über ein Kohlensäure-Zwischenprodukt als Teil des Bicarbonat-Puffersystems spielt:

Bei den beschriebenen chemischen Bestandteilen handelt es sich um dieselben, die auf natürliche Weise zur Regulierung des physiologischen pH-Werts bei Säugetieren über Atmungs- und Ausscheidungsstoffwechselprozesse verwendet werden33,34. Wenn CO2 Perfusat oder Kulturmedien mit Bicarbonatpuffer zugeführt wird, stabilisiert es den pH-Wert innerhalb eines physiologisch akzeptablen Bereichs für Nervengewebe von Säugetieren: 7,3–7,435,36. Aus diesem Grund wird CO2 allgegenwärtig in Carbogen-Gasmischungen (95 % O2, 5 % CO2) verwendet, die bikarbonatgepufferten Gewebekultursystemen zugeführt werden. Die Zugabe von CO2 zu einem solchen System führt zu einem Anstieg der Kohlensäure und damit zu einem Anstieg der Bicarbonat- und Wasserstoffionen, in die diese Verbindung dissoziiert, was letztendlich zu einer Senkung des pH-Werts führt. Wenn umgekehrt die Bedingungen in den Medien zu sauer werden, werden überschüssige Wasserstoffionen von Bikarbonat abgefangen und durch die Freisetzung von CO2 in Wassermoleküle eingebaut, was zu einem Anstieg des pH-Werts führt. Die Aufrechterhaltung physiologisch relevanter pH-Bedingungen in einem Bikarbonat-gepufferten Medium hängt daher von einer konstanten Zufuhr von CO2-Gas ab. Die CO2-Konzentration in den in der aktuellen Studie verwendeten Carbogen-Mischungen (5 %) entspricht einem Industriestandard, der bekanntermaßen ausreicht, um diese Bedingungen aufrechtzuerhalten; Als dieses jedoch als Versorgungsgas in Verbindung mit dem externen Membranoxygenator verwendet wurde, betrug der an der Stelle der Gewebeperfusion gemessene pH-Wert 8,13: übermäßig alkalisch im Vergleich zu unserem Ziel-pH-Bereich von 7,3–7,4. Diese Daten wurden beobachtet, obwohl im aCSF-Reservoir, das zur Versorgung der Anlage mit Perfusat verwendet wurde, die Ziel-pH-Bedingungen aufrechterhalten wurden (Tabelle 1). Unsere mit dem externen Oxygenator durchgeführten pH-Messungen in Verbindung mit unserem Wissen über die oben beschriebene Bicarbonat-Pufferchemie deuteten darauf hin, dass in unserem aCSF an der Stelle der Gewebeperfusion eine unzureichende Versorgung mit Bicarbonat-Ionen – und damit freien Protonen – aufrechterhalten wurde. Da dieses Problem in unserem aCSF vor der Gewebevertiefung nicht auftrat, konnten wir daraus schließen, dass sich die unbeabsichtigte pH-Verschiebung entwickelte, als unser Perfusat die Länge des Perfusionsgeräts durchquerte: insbesondere die 5 m langen Perfusionsleitungen, die den externen Membranoxygenator verbinden zu unserer Gewebeperfusionskammer. Als wahrscheinlichste Ursache für die beobachtete Verschiebung wurde somit ein Abfall des pCO2 ermittelt, der über die längere Distanz der Perfusionslinien auftritt, die erforderlich ist, um die Mitte des bildgebenden Spektrometers zu erreichen. Die Ergebnisse unserer O2-Tests mit dem oben beschriebenen externen Oxygenator (Tabelle 1) bestätigten später, dass durch Diffusionsprozesse eine übermäßige Menge gelösten Gases durch unsere Perfusionsleitungen entwich.

Während eine Vielzahl von Puffern verfügbar sind – vor allem die Good-Puffer, die in den meisten biologischen Forschungen verwendet werden37 –, hat sich gezeigt, dass nicht-bikarbonatgepufferte Perfusatsysteme das Ruhemembranpotential von Hippocampus-Neuronen verändern38. Obwohl physiologisch relevante pH-Werte durch den Ersatz des Natriumbicarbonats durch ein alternatives Puffermittel möglicherweise einfacher zu erreichen gewesen wären, hielten uns bestimmte Überlegungen – einschließlich der Aussicht auf zukünftige Funktionsstudien – davon ab, eine solche Lösung einzusetzen. Darüber hinaus hätten wir durch den Wechsel der Puffer zwar möglicherweise einen physiologisch relevanten pH-Wert erreichen können, wenn wir den externen Oxygenator eingesetzt hätten, es blieben jedoch Probleme mit dem Verlust von gelöstem Sauerstoffgas bestehen.

Nach der Integration des In-Bore-Membranoxygenators in unsere Mikroperfusionsanlage wurden die pH-Werte in der Gewebevertiefung auf den Ziel-pH-Bereich reguliert (Tabelle 1). Der Abstand zwischen der endgültigen Stelle der Perfusatbegasung und der Gewebeprobe wurde nach dem Austausch der Oxygenatorgeräte um den Faktor 250 (5 m vs. 2 cm) verringert (Abb. 3). Eine solche Verringerung der Länge der Perfusionslinien zwischen den Stellen des Gasaustauschs und der Gewebeperfusion verhinderte den Verlust von gelöstem CO2, indem sowohl die Gesamtoberfläche als auch die Zeit, in der diese Diffusionsverluste auftreten könnten, verringert wurden.

Die überwiegende Mehrheit der bisherigen Ex-vivo-MR-Mikroskopiestudien verwendete diskontinuierliche Perfusion als Teil ihres Bildgebungsprotokolls, um Flussartefakte zu eliminieren, die durch die Bewegung des Perfusats entstehen39,40,41,42,43,44,45,46. Während Kontrollexperimente in diesen Studien über die Stabilität des MR-Signals unter Verwendung intermittierender Perfusionsmethoden berichteten, haben Stoffwechselstudien gezeigt, dass Gewebeexplantate physiologisch vom kontinuierlichen Perfusatumsatz profitieren47,48. Angesichts der Rolle des Perfusats sowohl bei der Bereitstellung lebenswichtiger Nährstoffe als auch bei der Entfernung der toxischen Nebenprodukte des Stoffwechsels sind solche Ergebnisse nicht überraschend. In der aktuellen Studie haben wir aufgrund der geringen Eindringtiefe der Mikrooberflächenspule und ihrer räumlichen Trennung vom Perfusat aufgrund der Gewebetrennung (300 μm, Abb. 1) die Hypothese aufgestellt, dass die Perfusion während der Bildaufnahme aufrechterhalten werden kann, ohne dass Strömungsartefakte entstehen . Um dies zu testen, verglichen wir Diffusionserfassungen des fixierten Mauskortex über einen Zeitraum (21 Stunden) unter Bedingungen sowohl kontinuierlicher Perfusion als auch statischer, bewegungsloser Perfusierung (Abb. 5). In ähnlichen diffusionsgewichteten Scans von perfundierten, akuten Hippocampusschnitten, die in unserer Forschungsgruppe durchgeführt wurden, wurde die Signalstabilität über einen Zeitraum von 8 Stunden unter Verwendung eines intermittierenden Perfusionsprotokolls nachgewiesen, das alle 1,5 Stunden eine 5-minütige Perfusion mit einer Rate von 2 ml/min bereitstellte der Scanzeit49. Die Autoren berichteten über eine etwa 8-prozentige Variation des Rohdiffusionssignals über das 8-Stunden-Intervall für ihre stabile, perfundierte Gewebegruppe. Dieser Wert liegt ziemlich nahe an der Variabilität des rohen Diffusionssignals von 9 %, die in der aktuellen Studie für unsere statische Kontrollgruppe angegeben wurde (Abb. 5). Angesichts der Unterschiede zwischen den beiden Studien – insbesondere der Verwendung von akuten statt fixierten Schnitten – ist die beobachtete auffallend ähnliche Variation des Diffusionssignals eher auf Stabilitätsbeschränkungen der verwendeten Bildgebungshardware zurückzuführen als auf Veränderungen, die innerhalb der Gewebeprobe auftreten.

Im Fall unseres Experiments mit lebendem Gewebe, das an akuten kortikalen Schnitten durchgeführt wurde, blieb die Stabilität des Diffusionssignals für einen Zeitraum von 15,5 Stunden nach dem Zeitpunkt des Todes (TOD) und der anschließenden Probenvorbereitung vor der Bildgebung erhalten (Abb. 6). Die Schnittdicke (300 μm) und die Betriebstemperatur 23 °C wurden ausgewählt, um eine ausreichende Sauerstoffspannung in der gesamten Probe zu erreichen, während die Perfusatbedingungen (95 % gelöstes O2, 2 ml/min Durchflussrate) eine effiziente Metabolitenabgabe und Abfallentfernung gewährleisteten50,51. Umgekehrt ging der frühe Anstieg der Intensität des Diffusionssignals, der in der nicht durchbluteten, lebenden Scheibe beobachtet wurde, mit einem Zellödem einher, das durch ein Versagen der Ionenpumpen in den Plasmamembranen der Zellen der Scheibe verursacht wurde, das mit dem ATP-Abbau zusammenhängt52,53. Die durch Hypoxie verursachte Gewebeschwellung ist der physikalische Mechanismus, der für die Abnahme der Diffusionsfähigkeit innerhalb der Schicht verantwortlich ist, die sich in einem Anstieg des diffusionsgewichteten MRT-Signals äußert. Proben, die mit dem In-Bore-Oxygenator perfundiert wurden, zeigten eine weitaus höhere Diffusionssignalstabilität als die durch Metaboliten beeinträchtigte Kontrolle, da ihre Diffusionssignaländerung im Laufe der Zeit derjenigen ähnelte, die in der fixierten Gewebeprobe beobachtet wurde. Wie zu erwarten war, nahm die Variabilität zwischen den Gruppen in den gemittelten Daten unserer vier perfundierten Proben mit der Zeit zu, was an der zunehmenden Amplitude des über die Zeit gemessenen Fehlers erkennbar ist (Abb. 6b). Interessanterweise zeigte die kontinuierlich perfundierte Probe jedoch von den vier perfundierten Schnitten mit Abstand die stärkste zeitliche Änderung des Diffusionssignals, obwohl davon ausgegangen wurde, dass dieses Gewebe den günstigsten Stoffwechselbedingungen ausgesetzt war (Abb. 6a). Es ist zu beachten, dass diese Veränderungen nach dem 14-Stunden-Zeitpunkt auftraten: später als der 6- bis 12-Stunden-Zeitraum, über den akute Schnitte für elektrophysiologische Aufzeichnungen lebensfähig sind, und viel später als die 4-Stunden-Grenze, nach der beeinträchtigte, argyrophile Neuronen unter ähnlichen Bedingungen beobachtet wurden physiologische Aufrechterhaltung54. Solche Auswirkungen auf die Gesundheit der Scheiben wurden mit der Exposition gegenüber Lipopolysacchariden und Lipopeptiden in den Zellwänden von Bakterien in Verbindung gebracht55. Diese Bakterien sind in Perfusionsmedien vorhanden und unterliegen einem logarithmischen Anstieg der Populationsdichte, der zwischen der 6. und 12. Stunde der Inkubation beginnt. Glücklicherweise wurden bereits technische Lösungen entwickelt, die die Proliferationsrate von Bakterien im aCSF-Perfusat und damit den Zeitraum verlängern, über den akute Schnittpräparate funktionsfähig bleiben. Mithilfe von Temperaturunterdrückung und Filterung von ultraviolettem (UV) Licht haben Forscher an der University of Western Sydney ein spezielles Perfusionssystem entwickelt, das in der Lage ist, die elektrophysiologischen Eigenschaften akuter Schnitte für Zeiträume von 24 bis 36 Stunden zu bewahren56. Der nachgewiesene Erfolg solcher Techniken hat enorme Auswirkungen auf die Sammlung von MR-Mikroskopiebildern, deren Fertigstellung normalerweise Stunden dauert. Der Einbau eines UV-Filtergeräts vor dem In-Bore-Oxygenator in den aktuellen Aufbau – möglicherweise integriert in den Blasenfallenmechanismus – hat das Potenzial, die Lebensfähigkeitsdauer in Gewebeexplantatstudien zu verdoppeln oder zu verdreifachen.

Wir hoffen, dass das hier beschriebene und getestete aktuelle Rig-Design in zellularauflösenden MR-Studien lebender Gewebeexplantate eingesetzt werden kann und bei der zukünftigen Entwicklung MR-kompatibler Perfusionsgeräte hilft.

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Referenzen herunterladen

Wir danken unseren Kollegen bei UF: S Roper, G Walter, M King, J Lin, L Su, B Vemuri, M Grant, G Peter. Extern: G. Stanisz (Universität Toronto), L. Guay-Woodford (Universität Birmingham, Alabama). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (NIH 1R01EB012874-01) (S10RR031637) und der National Science Foundation (Kooperationsvereinbarung Nr. DMR-1157490) durch das National High Magnetic Field Laboratory (NHMFL) Advanced Magnetic Resonance Imaging und unterstützt Spektroskopie-Einrichtung (AMRIS) an der UF und im Bundesstaat Florida.

Abteilung für Neurowissenschaften, University of Florida, Gainesville, Florida, Vereinigte Staaten von Amerika

Jeremy J. Flint und Stephen J. Blackband

McKnight Brain Institute, University of Florida, Gainesville, Florida, Vereinigte Staaten von Amerika

Jeremy J. Flint, Kannan Menon und Stephen J. Blackband

Abteilung für Biomedizintechnik, University of Florida, Gainesville, Florida, Vereinigte Staaten von Amerika

Ich unterstütze Menon

Zentrum für funktionell integrative Neurowissenschaften, Universität Aarhus, Aarhus, Dänemark

Brian Hansen

Abteilung für Radiologie, University of Florida, Gainesville, Florida, Vereinigte Staaten von Amerika

John Forder

National High Magnetic Field Laboratory, Florida State University, Tallahassee, Florida, Vereinigte Staaten von Amerika

Stephen J. Blackband

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JJF, BH und JF entwarfen den Prototyp des Mikroperfusionsgeräts. JJF und BH stellten den Prototyp des Mikroperfusionsgeräts her. JJF entwarf den Prototyp des In-Bore-Oxygenators. JJF und KM stellten den Prototyp des In-Bore-Oxygenators her. JJF und KM führten die Datenerfassung durch. BH und JJF führten die Datenanalyse durch JJF, BH, JF, KM und SB haben das Manuskript geschrieben und bearbeitet.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Flint, J., Menon, K., Hansen, B. et al. Ein Mikroperfusions- und In-Bore-Oxygenatorsystem, das für Magnetresonanzmikroskopie-Studien an lebenden Gewebeexplantaten entwickelt wurde. Sci Rep 5, 18095 (2015). https://doi.org/10.1038/srep18095

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Eingegangen: 12. August 2015

Angenommen: 06. November 2015

Veröffentlicht: 15. Dezember 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep18095

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